人瘦素放射免疫分析法的建立及初步临床应用.pdfVIP

人瘦素放射免疫分析法的建立及初步临床应用 赵明辉，张春明，王德芝，王彦，韩佩珍 (中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所，天津300192) 摘要：瘦索是由肥胖基因编玛，由脂肪细胞合成和分泌的一种亲水性激素蛋白。分子量lfiKD， 是脂肪分解和合成代谢的主要调节园子。本文用高纯的重组人瘦素(1eptin，LEP)抗原免疫家 兔，得到高效价的兔抗人瘦索多克隆抗体，氯胺～T法制备mI一瘦崇标记物，建立人血清瘦素 放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)。本方法特异性强，灵敏度较高，精密度较好，其 测定值弓LINCO公司的放免药盒有很好的相关性。 、关键词：瘦素，多克隆抗体，放射免疫分析 瘦素(1eptin，LEP)是由脂肪细胞合成和分泌的一种激素蛋白，自1994年被发现以来， 由于其广泛而复杂的生理作用，使其在生物医学的多学科领域中得到研究和应瑚。国外的 血清瘦素测定方法来自美国LINCO公司的放射免疫分析试剂盒。本文用SIGMA公司的高 纯重组人瘦素免疫家兔，得到高效价的兔抗人瘦素多克隆抗体，氯氨一T法制各”jI一瘦素 标记物，建立人血清瘦素放射免疫分析法。 材料和方法 1材料 l，1．重组人瘦素：E．coli中表达：纯度9％；美国Sigma公司产品。 1_2，放射性核素碘125：Na”。I；Amersham。 1．3．纯种新西兰大耳自家兔：雄性；中国医学科学院动物所提供。 1．4．福氏完全佐剂和不完全佐剂：Sigma。 1．5．DEAE—Sephadex Biotech公司。 A一25和SephadexG50(Fine)：瑞典Pharmacia 1．6．二抗：羊抗兔；天津协和医药科技有限公司生产中心提供。 2．方法： 2，1．兔抗人瘦素多克隆抗血清的制备：选取2～2．5kg的雄性新西兰大耳自家兔。抗原为 重组人瘦素，按常规程序免疫。两次加强免疫后，取血用放免法鉴定。颈动脉放血收集血 清，加0．1％叠氮钠防腐，-20℃保存。 2．2．瘦素的”5I标记(氯胺—T法)：氯胺一T及偏重弧硫酸钠用0．01MpH7．4的PBS配制， 前者需在使用时新鲜配制。标记反应杯中依次加入：瘦素10¨∥10江，、Na“5IlmCi／5IaL、 氯胺一T30”g／301aL。室温搅拌下反应45秒，快速加入601J_g／30儿偏重亚硫酸钠终止反应。 定每管的放射性计数。 2．3．瘦素放免法的建立 2．3．1．抗血清最佳工作稀释度的选择：选用B／T结合率在25～50％的相应抗血清稀释度， 分别做标准曲线。 2．3．2．反应时间、温度的选择：设计不同的反应条件：37℃×lhr，37℃×2hr，37℃×3hr， 4℃过夜。 2．4．方法学考核： 2．4．1．灵敏度：用10组Bo／T％o的均值减去2倍标准差所对应的剂量表示。 2．4，2．特异性：50％置换法计算交叉反应。 的标准品，再次测定，计算回收率。 2．4．4．精密度：批内和批间变异系数(cv％)。 2．4．5．健全性：通过平行性试验，将一重度肥胖病人血消倍比稀释后，检测三个浓度值， 检测结果与标准曲线绘制在同～陶中得到稀释曲线，观察其与标准曲线的关系。 2．4．6．稳定性：两个月内用同样试剂进行20次RIA检测。 2．5．初步临床应用 2．5．1．成年健康体检者瘦索浓度与体重指数(B^_II)之间的关系分析：血清样本来自天津 市血液中心的成年健康献血者112例，确认排除其他内分泌疾病，年龄为18～54岁，男性 52例t女性60例，记录身高和体重，BMI用体重除以身高的平方(kg／m2)来表示。用本 文RIA方法测定血清瘦素浓度。 2 5 2．成年男性睾酮水平与瘦素浓度相关性分析：放免法测定130例。 结果 1，兔挠人瘦素多克隆抗体的质量鉴定 1．1，抗血清滴度的测定：为1：8000。 1．2．抗体亲和力的测定：Ka=1．25×10”L／mol，说明该抗血清可用于RIA。 1 3．抗体特异性的检测：人一Lep与兔一Lep和鼠--Lep的交义反应率分别为0．1％}tl0．15％， 均O．2％。而与人Ins、C-肽、GLU、FSH、LH、TSH、PRL、GH的交叉反应朱检出。 2．人瘦素的”5I标记、纯化和鉴定 2．1瘦素的标记和