人血管内皮生长因子受体2KDR基因胞内区酪氨酸激酶催化区域TKC克隆表达及其抑制剂筛选模型的构建研究.pdfVIP

人血管内皮生长因子受体2(KDR)基因胞内区酪氨酸激酶 催化区域(TKC)克隆表达及其抑制剂筛选模型的构建研究 刘春平李元 中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所生物工程室 邮编100050 电话：010 sprin继．ace@tom．com 血管内皮生长因子(VEGF)是一种二聚体蛋白，对血管内皮细胞具有特异的 致分裂作用，可促使内皮细胞分裂增殖，促使新生血管形成，同时还可有效地提 高血管的通透性。VEGF这一功能是通过和其特异性受体结合来发挥作用的。VEGF 号传导的主要执行者，VEGF结合激发KDRTK磷酸化，导致下游信号相关酶类 的激活，从而调节血管内皮细胞相关反应。新生血管的形成对恶性肿瘤的生长是 必不可少的因素，因而以KDRTK为靶点进行药物设计和筛选可成为抗肿瘤血管 生成的重要方略。 氨基酸。KDR胞内区有565个氨基酸组成，可分为激酶功能区、68个氨基酸的酪 氨酸激酶插入区和C末端。 本研究从人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中提取总RNA，以其为模板，’通过 RT-PCR扩增获得编码KDR TKC的基因片段，将此基因片段分别和载体pET-30a 及PUCl8连接进行测序，测序结果和已知KDR基因编码序列进行了比较，结果 完全一致。 首先在大肠杆菌中进行了KDRTKC的的基因片段的克隆表达。将该基因片段 插至含有T7启动子的表达载体pET-30a，经酶切验证正确后，将获得是重组质粒 成，目前正在优化蛋白表达条件，行SDS．PAGE分析，重组的蛋白以可溶性和包 涵体两种形式存在。采用Westernblot、受体配体配基结合实验研究重组蛋白是否 具有免疫活性和与配基结合的生物学活性。 另外利用本实验室自行构建的新型链霉菌一大肠杆菌穿梭质粒pSGLgpp作为 KDR TKC的基因片段的表达载体。将测序正确的基因片段从PUCl8载体上酶切 KDR TKC的基因片段的分泌表达。重组质粒酶切验证正确插入该基因片段后，转 化至S．1ividansTK24原生质体，得到的转化子再生后将该重组菌称为 blot、受体配体配基结合实验 S．1ividans[pSGLgpp．kdr]。采用SDS．PAGE、Western 分析表达上清中蛋白表达的最优的条件、免疫活性和与配基结合生物学活性。 涵体的形式存在，需进行复性处理，再进行Ni2+一螯合亲和层析以得到纯化的重 组蛋白。 TKC的蛋白，再采用 冷冻干燥等一系列步骤处理，以得到纯化的KDR 73 MALDI．TOF．MS的方法测得K．DRTKC的分子量。 以纯化的K_DRTKC的蛋白为靶位，建立KDRTKC的抑制剂筛选模型，从合 成化合物及天然产物中获得新型的物质，可望成为筛选新型抗肿瘤药物的有效方 法。 TKC 本研究首次在链霉菌中分泌表达KDRTKC的区域，并将构建新型KDR TKC的的分离纯化研究为 的抑制剂筛选模型，具有较突出新颖性。对重组的KDR 将该蛋白的实际应用奠定良好基础。 74