环磷腺苷葡胺注射液细菌内毒素检测探究.doc

环磷腺苷葡胺注射液细菌内毒素检测探究 　　摘 要：目的：探究环磷腺苷葡胺注射液细菌内毒素检查方法的可行性。方法：确定该供试品的细菌内毒素理论限值后，分别用两种不同厂家生产的鲎试剂对3批供试品进行干扰试验。结果：注射用环磷腺苷葡胺稀释40倍时对细菌内毒素检查法没有干扰作用，细菌内毒素限值符合规定。结论：该方法操作简便、灵敏，可用此法代替原有的家兔热原检查法 关键词：细菌内毒素；环磷腺苷葡胺；鲎试剂；干扰试验 环磷腺苷葡胺注射液是一种非洋地黄类强心剂，可用于冠心病、心肌梗死等，也可用于急性白血病的缓解治疗[1-2]。《中国药典》2010年版规定以家兔法进行热原检查，但家兔法操作繁琐，在实际情况中家兔体温会有异常波动，给检验造成困难[3]。本文进行了细菌内毒素检查法代替家兔法的可行性试验，现报告如下 1.材料与方法 1.1 材料 注射用环磷腺苷葡胺（山东绿叶制药有限公司，批号：201404198、201406074、201408367，规格：60 mg）。鲎试剂（湛江安度斯生物有限公司提供，批号：0508215，规格：0.1 mL/支，灵敏度：0.125EUmL-1；厦门鲎试剂厂提供，批号：0406345，规格：0.1 mL/支，灵敏度：0.125EUmL-1）。细菌内毒素检查用水BET水（福州新北生化工业有限公司，批号：0909267，规格：5 mL/支） 1.2. 方法 1.2.1 细菌内毒素理论限值（L）的计算 根据公式L=K/M计算，L为供试品注射用环磷腺苷葡胺的细菌内毒素理论限值，K和M分别为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量和供试品剂量[4]，计算得出L=5EUmg-1 1.2.2 供试品最大有效稀释倍数（MVD）的确定 根据公式MVD=CL/λ计算，L为供试品注射用环磷腺苷葡胺的细菌内毒素理论限值，C为供试品稀释后的样品浓度，λ为鲎试剂的灵敏度值，计算出1gL-1的环磷腺苷葡胺溶液的MCD=40 1.2.3 供试品的最大不干扰浓度的干扰试验 用BET水将供试品梯度稀释成0.10 gL-1、0.05 gL-1、0.025 gL-1、0.0125 gL-1、0.00625 gL-1共5种浓度的稀释液。同时配制供试品阳性溶液，供试品阳性溶液为上述各溶液分别添加2λ（0.25EUmL-1）的细菌内毒素样品溶液制成。将鲎试剂用0.1 mLBET水溶解后，分别加入0.1 mL上述配制的各稀释浓度的供试品样品溶液和供试品阳性溶液，并设置阴性对照和阳性对照，37℃孵育1h后，观察实验结果，以此初步确定供试品的最大不干扰浓度[5] 1.2.4 供试品的最大不干扰浓度的确证试验 根据上述干扰试验结果，确认选择0.025gL-1浓度的供试品稀释溶液。用BET水和0.025gL-1供试品溶液分别将细菌内毒素工作标准品梯度稀释为0.25 EUml-1、0.125 EUml-1、0.0625 EUml-1和0.03125EUml-1共4种浓度的稀释液。将鲎试剂用0.1 mL BET水溶解后，分别加入0.1 mL上述配制的各浓度稀释液，37℃孵育1h后，观察实验结果 1.2.5 供试品的细菌内毒素检查试验 将供试品用BET水配制成0.025gL-1的稀释液，并同时设置试品阳性对照（2λ）、阴性对照和阳性对照（2λ），将鲎试剂用0.1 mL BET水溶解后，分别加入0.1 mL上述配制的各浓度稀释液，37℃孵育1h后，观察实验结果 2 结果 2.1 供试品的最大不干扰浓度的干扰试验 结果显示各稀释浓度对鲎试剂均无干扰反应，由于计算出1gL-1的环磷腺苷葡胺溶液的理论MCD为40，因此初步确定供试品的最终有效稀释浓度为0.025gL-1，详见表1 2.2 供试品的最大不干扰浓度的确证试验 结果显示，供试品的稀释浓度为0.025gL-1，对两个不同厂家生产的鲎试剂均没有产生干扰反应，详见表2 2.3 供试品的细菌内毒素检查试验 结果显示对3批环磷腺苷葡胺注射液进行细菌内毒素检查时，可以用稀释方法排除干扰，测定结果均为阴性，符合规定，详见表3 3.讨论 鲎试剂是一种公认的细菌内毒素检测用试剂，可广泛用于化学药、中药、生物制品等药物的细菌内毒素检测[6]。但许多药品对凝集反应具有一定的增强或减弱的干扰作用，使其结果并不准确，只有验证了供试品的稀释浓度对上述凝集反应没有干扰作用，鲎试剂的内毒素检测结果才具有准确性和可信性。本文研究结果显示供试品的稀释浓度为0.025gL-1，对两个不同厂家生产的鲎试剂均没有产生干扰反应，且40倍的注射用环磷腺苷细菌内毒素含量低于理论限值5EUmg-1，表明用鲎试剂法检测该供试品的细菌内毒素这一方