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加拿大学者利用印刷电极实现HIV蛋白酶的电化学检测 王娟?供稿时间：2007-9-18 　 艾滋病（AIDS）全称“获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome, AIDS）”，是一种由逆转录病毒——“人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）”引起的人体免疫防御系统机能缺陷，继而发生严重致命性感染的传染病[1]。艾滋病的死亡率极高，并且在全球的蔓延速度惊人。根据联合国艾滋病规划署和世界卫生组织2006年11月21日共同发布的《2006年全球艾滋病报告》，2006年全球艾滋病病毒感染人数达到3950万，而2006年每天大约有1.1万人新感染艾滋病病毒，95％的感染者分布在中、低收入国家[2]。2007年8月19日-23日，第八届亚洲－太平洋地区艾滋病国际会议在斯里南卡首都科伦坡举行。会议上来自70多个国家和地区的2500多名代表，就增强亚太地区乃至全球对艾滋病的防治工作，推动艾滋病预防、治疗和护理服务的普及等进行了讨论[3]。目前，公认疗效最好的“鸡尾酒疗法”也只能延缓艾滋病人的死亡，并不能彻底治愈艾滋病。所以，对于艾滋病有效治疗靶点及其抑制剂的研究仍是备受关注的领域。 ? 2007年8月份，加拿大Saskatchewan大学Kraatz教授领导的研究小组公布了他们在艾滋病治疗研究方面取得的最新进展[4]。该工作题为“HIV－1型蛋白酶的电化学检测方法”（An electrochemical approach for the detection of HIV-1 protease）发表在英国皇家化学学会刊物Chem. Commum.上。Kraatz研究小组利用自己合成的二茂铁－抑肽素加合物为探针构建了基于印刷电极的传感器，成功实现了HIV－1型蛋白酶的快速、方便的电化学检测。用于检测的印刷金电极如图1所示。 ? 图1：印刷金电极[5] ? HIV－1型蛋白酶是HIV病毒粒子组装、成熟过程不可缺少的酶类，抑制其活性能够阻止未成熟的病毒粒子发育成具有感染性的HIV病毒。因此，HIV－1型蛋白酶成为抗AIDS治疗的重要靶点。HIV－1型蛋白酶属于一种分泌酶（aspartyl protease）。抑肽素（pepstatin）可以和分泌酶的活性位点结合，强烈抑制该类酶的活性[4]。Kraatz研究小组合成了二茂铁－抑肽素加合物（feerocene－conjugated pepstatin），结构如图2所示。 ? 图2：二茂铁－抑肽素加合物[4] ? 这种“生物有机金属化合物”通过二茂铁一端修饰的巯基与金表面形成“金－硫键”固定于金电极表面，同时以二茂铁作为电化学信号指示探针，抑肽素作为HIV－1型蛋白酶的结合探针，利用电化学方法对HIV－1型蛋白酶进行检测，如图3所示。采用印刷金电极则有利于该传感器的大规模生产及商品化。 ? 图3：A 二茂铁－抑肽素加合物在金电极表面的固定，及二茂铁的循环伏案图；B HIV－1型蛋白酶与抑肽素结合，及二茂铁循环伏安电化学信号的改变[4] ? “二茂铁－抑肽素加合物”固定到印刷金电极表面后，施加一定范围电位时,二茂铁产生特征电化学信号，如图3A所示。溶液中的HIV－1型蛋白酶与金电极表面固定的抑肽素结合后，能够显著改变二茂铁的电化学行为，如图3B所示。通过HIV－1型蛋白酶与抑肽素结合前后二茂铁的电化学信号的不同，可以检测出HIV－1型蛋白酶。二茂铁的电化学信号（如氧化还原适电位及峰电流）与结合的HIV－1型蛋白酶的量成一定比例关系。如图4A所示，随着HIV－1型蛋白酶浓度增大，二茂铁的氧化还原电位逐渐正移，峰电流逐渐降低。根据氧化还原适电位及峰电流密度值可以计算所结合的蛋白酶的量（如图4B，4C所示）。 ? 图4：A 二茂铁－抑肽素加合物修饰印刷金电极在分别含有（a）40 nM，（b）60 nM，（c）100 nM HIV－1型蛋白酶及（d）未修饰金电极在100 nM蛋白酶溶液中的循环伏安图；B 二茂铁氧化还原适电位与蛋白酶浓度关系；C 二茂铁氧化还原峰电流密度与蛋白酶浓度关系[4] ? 这种电极还可以用于HIV－1型蛋白酶抑制剂的研究。松胞菌素A（Cytochalasin A）也是一种HIV－1型蛋白酶的抑制剂，并且可以和抑肽素竞争结合HIV－1型蛋白酶[4]。当溶液中存在松胞菌素A时，就会减少蛋白酶和电极表面抑肽素的结合，从而可以通过二茂铁电化学信号改变测量松胞菌素A。如图5A所示，在含有相同浓度HIV－1型蛋白酶时，溶液中松胞菌素A浓度越大，由于蛋白酶结合造成的二茂铁电化学信号改变就越小，相应的二茂铁氧化还原适电位及峰电流密度也与松胞菌素A浓度成一定比例关系（如图5B，5C所示）。 ? 图5：A 二茂铁