DAPK对IFNγ抑制PGCl3细胞恶性表型的影响论文.docVIP

　　DAPK对IFNγ抑制PGCl3细胞恶性表型的影响论文 【摘要】 目的 探讨肿瘤转移抑制基因DAPK对IFNγ抑制高转移肺癌PGCl3细胞株运动、侵袭、黏附、克隆形成率的影响。方法 用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体pcDNA3.1,将抑癌基因DAPK转入高转移肺癌PGCl3细胞中,经G418筛选,获得稳定表达的细胞克隆。观察DAPK增强INFγ抑制PGCl3细胞增殖、运动、侵袭、黏附、克隆形成率。结果 DAPK基因转染的PGCl3细胞对INFγ敏感。IFNγ抑制转染DAPK基因的PGCl3细胞的增殖、侵袭能力、运动能力、黏附能力、克隆形成率，而且IFNγ的影响呈剂量依赖性。结论 肿瘤转移抑制基因DAPK增强INFγ抑制PGCl3细胞的恶性表型。 【关键词】 死亡相关蛋白激酶 转移 肺癌 0 引言 死亡相关蛋白激酶（death associated protein kinase,DAPK）是一类新的钙离子/钙调素依赖激酶，使其底物蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化，该激酶最初是作为γ干扰素（IFNγ）诱导细胞凋亡的一种正调控子被分离鉴定1。研究表明，许多肿瘤细胞中DAPK是失活的，过表达的DAPK抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，DAPK是一个潜在的肿瘤抑制基因和抑制肿瘤转移的基因24。本研究将DAPK基因导入高转移人肺癌细胞株（PGCl3细胞株）,观察IFNγ对过表达DAPK的肺癌细胞生物学行为的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 PGCl3细胞株(广东医学院生化教研室提供)以含10%小牛血清的RPMI1640培养液于5% CO2中培养; pcDNA3.1DAPK质粒5（张海涛博士赠送）。四甲基偶氮唑蓝(MTT), Aprotinin.freela公司); LipofectAMINE2000 Reagent (invitrogen公司); IFNγ，RPMI1640(Gibco公司);小牛血清(杭州四季青公司);Costar Trans,Corning公司),Matrigel,.freelinol reagent(北京中山)。 1.2 方法 1.2.1 细胞转染 以pcDNA3.1DAPK与pcDNA3.1分别转染PGCl3细胞。参照lipofectamine2000说明书,将细胞接种于24孔板，含10%的小牛血清的RPMI1640培养液5% CO2培养。用无血清的DMEM培养液漂洗细胞3次。含0.8μg的质粒溶液与无血清DMEM培养液混合终体积为50μl；2.0μl的lipofectamine2000与48μl无血清DMEM培养液混合终体积为50μl。室温孵育5min，将稀释的DNA与质脂体混合，继续孵育20min。将100μl混合好的DNA与质脂体溶液滴到细胞表面，来回混匀，培养24h后，胰酶消化细胞，加不含抗生素的培养基按1∶6稀释细胞，接种，继续培养24h，加入含1mg/ml的G418培养液进行抗性筛选，每3～5天弃掉死细胞，更换培养液。2～3周可见有克隆形成，换含500μg/ml G418培养液维持培养。挑取克隆进行扩增培养，免疫印迹检测DAPK基因表达。免疫印迹方法参照《分子克隆实验指南》第2版。 1.2.2 DAPK基因对PGCl3细胞生长的影响 收集转染组及对照组PGCl3细胞,分别用含10%小牛血清的RPMI1640培养基培养,调整细胞浓度至2×105/ml,用96孔培养板(每孔加入100μl细胞悬液)37℃、5% CO2孵箱中培养, 加不同浓度的IFNγ处理，用MTT法测细胞生长。记录各组细胞的吸光值,作图,每组重复4次,取平均值。 1.2.3 集落形成实验 参照文献提供的方法6，加不同浓度的IFNγ处理各组细胞。 1.2.4 侵袭实验 采用Corning公司生产的研究侵袭运动用的Costar Transl),下室加入含10μg/ml Fibronectin的10%血清的培养基600μl。收集各组PGCl3细胞1×106/ml,取100μl,加入已铺有Matrigel的孔内, 加不同浓度的IFNγ处理。置37℃、 5% CO2孵箱培养24h后取出多聚碳酸酯膜,擦去膜上未穿过的细胞,将膜用甲醇/丙酮固定10min后HE染色,透明液透明,光镜下计数穿膜细胞数。 侵袭百分率=实验组侵袭细胞数/空白对照组细胞数×100%,每组重复4次,取平均值。 1.2.5 运动实验 除不涂布Matrigel膜外,其余操作步骤及计数方法同侵袭实验。 运动能力=实验组细胞数/空白对照组细胞数×100%。每组重复4次,取平均值。 1.2.6 粘附实验 取96孔培养板,每孔加入Matrigel 20