DDR2-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达论文.docVIP

　　DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达论文 张燕 王保莉 苏金 车红磊 于江天 刘新平 【关键词】 ,盘状结构域受体2；Fc；DS区域；融合表达 【Abstract】 AIM: To construct the eukaryotic expression vector of DDR2Fc fusion gene and to investigate its expression in HEK293 cells. METHODS: The tplified by PCR respectively from the rat brain tissue and the plasmid containing the fulllength cDNA of human IgG1 Fc,and cloned to the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-) by directional cloning. The resultant rebinant plamid pcDNA3.1(-)/DDR2Fc e transfection reagent. Then RTPCR, MPs)的表达水平上调［1-2］. DDR2在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,.freelain［5］与IgG1 Fc段融合起来在293细胞中进行表达,使其具备有活性的二聚化状态，为进一步研究其竞争性阻断剂功能奠定基础. 1材料和方法 1.1材料雄性SD大鼠（第四军医大学实验动物中心）；293细胞、pcDNA3.1(-)真核表达载体、大肠杆菌XL10菌株(本室保存)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；DMEM培养基(Gibco公司)；抗Fc抗体(第四军医大学免疫教研室惠赠)；D18T载体,T4DNA连接酶（TaKaRa公司）；质粒提取和DNA回收试剂盒（安徽优晶公司）. 1.2方法 1.2.1引物设计DDR2的DS domain片段（命名为DS）的上游引物序列：5′TCT AGA GTC GAC CTG AAA TGA TCC TGA TTC CCA GAA TG3′,其中TCT AGA序列为XbaⅠ酶切位点；DS的下游引物序列：5′GGT ACC TCC ACA ACC ATA AAG CTC GAC CCT CAT G3′,其中GGT ACC序列为KpnⅠ酶切位点，TCC为额外引入的序列，将翻译成2个片段之间的柔性氨基酸Gly. Fc段的上游引物序列： 5′GAA TTC GGT ACC GGA GGC GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA AC3′,其中GAA TTC序列为EcoRⅠ酶切位点.freelin，再加入5×RT buffer 5 μL，dNTP（10 mmol/L） 2.5 μL，AMV 1 μL，补DEPC水至25 μL，于42℃下反应1 h后95℃ 5 min终止反应. 1.2.3PCR扩增及产物修饰在200 μL反应体系中加入10×buffer 20 μL，dNTP（10 mmol/L）4 μL、上下游引物（10 μmol/L）各4 μL、模板DNA(脑组织cDNA,Fc质粒)各8 μL,pfu 4 μL,Taq 1.2 μL，补水至200 μL. PCR扩增条件为94℃ 5 min，94℃ 1 min，52℃ 1 min，68℃ 2 min，后3步进行35个循环,最后，68℃延伸10 min. 扩增产物回收后溶于30 μL TrisHCl（pH 8.0）中，并进行加“A”反应. 1.2.4PCR产物克隆及序列测定上述加“A”后的PCR产物回收后直接与pMD18T载体连接，转化大肠杆菌XL10后，挑选克隆进行EcoRⅠ/HindⅢ酶切,鉴定片段是否插入pMD18T载体中. 将阳性克隆送公司测序，将测序结果与GenBank中的基因序列进行比对. 1.2.5融合表达载体的建立和鉴定EcoRⅠ/HindⅢ酶切FcpMD18T,将Fc片段切下,插入pcDNA3.1(-)中,并用EcoRⅠ/HindⅢ进行酶切鉴定. 再用XbaⅠ/KpnⅠ将DSpMD18T中的DS切下,连入同样酶切过的FcpcDNA3.1(-),构建成DS/FcpcDNA3.1(-),用XbaⅠ/KpnⅠ,KpnⅠ/HindⅢ,EcoRⅠ/HindⅢ分别进行酶切鉴定. 1.2.6HEK293细胞的培养及质粒瞬时转染HEK293细胞用含有100 mL/L小牛血清的DMEM培养，转染前24 h传代，接种入6孔板中. 待转染细胞共分3组,分别是DS/FcpcDNA3.1(-)组、空载体pcDNA3.1(-)组和空对照组. 当细胞长至