DNAPKcs短发夹RNA载体的构建及其表达论文.docVIP

　　DNAPKcs短发夹RNA载体的构建及其表达论文 田晓予，邢辉，翁丹慧，陈刚，卢云萍，马丁 【摘要】 目的 构建DNAPKcsshRNA表达载体，观察该基因的抑制对A2780细胞增殖活性的影响。方法 将针对人DNAPKcs基因的不同部位设计的shRNA插入到真核表达质粒并转染人卵巢A2780细胞，RTPCR和TT（Sigma公司）， PCR引物及shRNA表达载体插入片段的寡核苷酸链由北京奥科生物公司合成，DNAPKcs shRNA表达载体的测序由大连亚法生物技术公司完成。 1.1.2 主要仪器 CO2培养箱（Hereaus公司）， PCR仪和蛋白垂直电泳系统（美国BioRad公司），酶标仪（美国Biotek公司产）。 1.2 方法 1.2.1 DNAPKcs 特异性shRNA转绿模板设计 选择人类DNAPKcs（Genebank U47077 ）cDNA两个部位作为目标序列，根据目前通用的siRNA设计原则，应用hppt:／／.ambion.提供的“siRNA target finder and design tool” 设计DNAPKcs 特异的19mt寡核苷酸序列加入9bp的loop环结构、U6启动子终止序列及两端的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，全长67bp ，以形成发卡状siRNA(shRNA)转录模板,正义链1：5’GATCCCATGGCAGGAGAGAATCAGTTCAAGAGACTGATTCTCTCCTGCCATGTTTTTTGGAAG3’反义链1：5’AATTCTTCCAAAAAACATGGCAGGAGAGAATCAGTCTCTTGAACTGATTCTCTCCTCCATGG3’正义链2: 5’GATCCCTTTATGGTGGCCATGGAGCAAGAGACTCCATGGCCACCATAAAGTTTTTTGGAAG3’反义链2:5’AATTCTTCCAAAAAACTTTATGGTGGCCATGGAGTCTCTTGAACTCCATGGCCACCATAAAGG3’。 1.2.2 DNAPKcs shRNA表达质粒的构建与鉴定 重组质粒构建与鉴定过程：(1)将备用的pSIREN载体经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳分离，以凝胶纯化试剂盒纯化备用。(2)退火：分别用TE30μl溶解寡核苷酸单链，使其浓度为100μmol, 两条单链各取5μl混合，经95℃ 30s、72℃ 2min、37℃ 2min、25℃ 2min退火后备用。(3)连接：稀释上述产物至0.5μmol，按以下体系操作：将纯化的质粒片段2μl, 退火产物1μl ,10×T4DNALigase buffer1.5μl,BSA(10mg/ml)0.5μl,T4DNALigase0.5μl,H2O9.5μl,.freelin解冻，轻叩使其重悬，取6μl连接产物直接加入细菌悬液，轻轻混匀，冰上放置30min ，42℃水浴45s，置冰上2min，加900μl LB培养液，37℃ 250r/min,60min摇匀；取100μl菌液置于选择性固体培养基，用弯玻棒涂匀，普通培养箱37℃培养12～14h，见培养皿中长出菌落，挑取菌落3～4个分别放入2ml LB +2μl Amp、350r/min、37℃过夜，观察培养液变混浊，取500μl 菌液按照质粒小样快速提取说明书提取质粒，剩余菌液加等量甘油于－80℃保存。提取的重组质粒行双酶切鉴定，将连接成功的质粒样本根据插入片段不同命名为pSIRENDNAPKcs shRNA1和pSIRENDNAPKcs shRNA2送测序。 1.2.3 重组质粒转染A2780细胞 取对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化，调整细胞浓度为5×105个／ml ，分别接种96、24和6孔板中，细胞融合度为50%～70％时参考脂质体转染说明书，用阳离子脂质体Lipfectinamine2000将空质粒载体pSIREN和重组质粒pSIRENDNAPKcs shRNA1、pSIRENDNAPKcs shRNA2分别转染A2780细胞,选用未转染的细胞作空白对照，96、24和6孔板终体积分别为100μl、500μl和2ml,每孔含质粒分别为0.2μg、0.8μg和4μg，每孔含脂质体分别为0.5μl、2.0μl和10μl。转染后6h更换1640完全培养液终止转染。 1.2.4 RTPCR 离心收集细胞， Trizol法提取细胞总RNA。逆转录条件：42℃ 60min、95℃ 5min、4℃ 10min,PCR条件：95℃ 预变性1min， 95℃ 30s、50℃ 45s、72℃ 10min、30个循环后，再72℃ 延伸10min。上游引物序列为5’TTATGCAG