EGFRvIII-PEP论文.docVIP

　　EGFRvIII/PEP论文 .freelmunogenicity analysis of the fusion protein Abstract AIM: To construct rebinant prokaryotic expression plasmid pET28a(+)/cPEP3c and evaluate the immunogenicity of the fusion protein. METHODS: cDNA fragment encoding PEP3 pGEMT Easy/PEP3 and inserted into rebinant plasmid pGEMEX/HBcAg. Then it ed into E.coli BL21(DE3). The fusion protein atography. BALB/c mice munized ined by indirect ELISA. RESULTS: The rebinant gene ed to be correct by restriction enzyme digestion and DNA sequencing. After prokaryotic expression, fusion protein existed in sediment and accounted for 56% of all bacterial lysate. The purified product accounted for 92% of all protein and its concentration reached 1∶16000 after the fourth immunization and reached 1∶2.56×105 after the sixth immunization. The titre of antiPEP3 antibody reached 1∶1.28×105 and the titre of antiHBcAg antibody alignant tumors al gromunogenicity 摘 要 目的: 构建EGFRvIII与HBcAg重组基因的原核表达质粒, 进行原核表达、 纯化, 观察表达蛋白的免疫原性和抗原性。方法: 通过双酶切从pGEMT Easy/PEP3载体获得编码EGFRvIII突变区的cDNA片段,.freelal groH I和Xho I双酶切重组质粒pGEMT Easy/PEP3及pGEMEX/HBcAg, 回收和纯化目的基因, 用T4 DNA连接酶连接载体pGEMEX/HBcAg和目的基因, 转化感受态E.coli DH5α, 挑选单菌落摇菌, 提质粒, EcoR I/Xho I酶切鉴定, 得到重组质粒命名为pGEMEX/cPEP3c。 1.2.2 构建表达质粒pET28a(+)/cPEP3c 用EcoR I和Sal I对重组质粒pGEMEX/cPEP3c和pET28a(+)进行双酶切, 回收和纯化目的片段, 进行DNA连接, 转化E.coli DH5α感受态细胞, 用Kana+培养基筛选阳性克隆, 小提质粒进行酶切鉴定并测序, 对筛选出的正确的重组质粒进行大量制备。 1.2.3 重组质粒pET28a(+)/cPEP3c的原核表达 用重组质粒pET28a(+)/cPEP3c转化E.coli BL21(DE3)受体菌, 同时用空质粒pET28a(+)转化BL21菌作对照。分别挑取单个阳性菌落接种入5 mL LB培养液中, 37℃振摇培养至培养液的A600达0.4～0.6。各取2 mL培养菌液加入200 mL Kana+的LB培养液中, 振摇培养3 h, 然后加入IPTG至终浓度为1 mmol/L, 继续振摇培养8 h, 诱导蛋白表达。 1.2.4 原核表达蛋白的分离和纯化 收集细菌用裂解缓冲液和超声细胞粉碎机裂解细菌, 分别收集上清和沉淀进行SDSPAGE分析, 考马斯亮蓝染色, 观察蛋白表达。将沉淀（包涵体）充分溶解于8 mol/L尿素中, 室温16 h, 收集上清, 在含复性液的透析袋中透析48 h, 收集上清即为复性后的表达蛋白。Ni2+NTA亲和层析法对融合蛋白进行纯化, 操作步骤按Novagen公司纯化手册的说明书进行, 120 g/L SDSPAGE分析、 考马斯亮蓝染色, 通过凝胶扫描分析融合蛋白表达水平, 对照标准蛋白曲线, 确定融合蛋白浓度。 1.2.5 免疫动物 BALB/c小鼠11只, 于腹腔注射融合蛋白100 μL/只, 每周免疫1次, 第1次使用完全弗氏佐剂与等量融合蛋白的乳化混合物, 第2次使用不完全弗氏佐剂与等量融合蛋白的乳化混合物, 此后