EGF对真皮成纤维细胞中cyclinD1和CDK┐4表达的影响论文.docVIP

　　EGF对真皮成纤维细胞中cyclinD1和CDK┐4表达的影响论文 .freelL L-1胎牛血清的DMEM.freelg L-1的EGF培养SD大鼠的真皮成纤维细胞，通过MTT检测、流式细胞仪分析观察细胞的生长状态，免疫组化检测cyclinD1和CDK-4的表达，结合流式细胞仪分析观察细胞的周期变化.结果MTT检测、流式细胞仪结果都显示50mg L-1的EGF能显著促进真皮成纤维细胞的生长增殖，免疫组化结果显示，二者一致.结论50mg L-1的EGF对真皮成纤维细胞的生长有极大的促进作用，促进了细胞周期蛋白cyclinD1和CDK-4的表达，使细胞G1期变短. Keyalgrois;fibroblasts Abstract:AIMToexaminethebiologicalbehaviorsofder-malfibroblastsinDMEMcontaining50mg L-1EGFandtoinvestigatetheexpressionsofcyclinD1andCDK-4.METH┐ODSDermalfibroblastsg L-1EGFand100mL L-1fetusbovineserum.Theproliferationabilitymunohistochemistrymethod.RESULTSDermalfibroblastsculturedinDMEMcontaining50mg L-1EGFshoorepositivesignalsforcyclinD1andCDK-4.CONCLUSIONThedermalfi-broblastsculturedinDMEMcontaining50mg L-1EGFL L-1胎牛血清的DMEM再加入50mg L-1的EGF（该浓度为预实验结果）和仅含100mL L-1胎牛血清的DMEM. 1.2.2分离培养真皮成纤维细胞无菌条件下取SD新生仔鼠背部皮肤，去除皮下组织，用含抗生素的PBS冲洗，将标本切成1mm×1mm×1mm大小，置于2.5g L-1的胰酶中，4℃放置过夜，仔细将表皮与真皮分离，将真皮放入含培养液的离心管中终止胰酶作用，反复吹打，过筛网，收集分离的细胞悬液，台盼蓝染色法行活细胞计数，用上述两种培养液以（1×105～1×106） cm-2密度分别接种.待细胞长满后，用2.5g L-1的胰酶消化传代，用上述两种培养液分成两组培养. 1.2.3MTT检测在96孔板上以4×103 cm-2的密度接种细胞.培养3d后，每孔加入MTT（5g L-1）20μL，继续培养4h，吸弃上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，充分振荡15min，酶联免疫分析仪测每孔A490nm值. 1.2.4流式细胞仪分析取细胞5×105个，800r min-1离心5min，弃上清，冷PBS洗涤2次，700mL L-1冷乙醇固定，4℃过夜.上机前离心去除乙醇，PBS洗涤2次，加入PI（溴化丙锭）染液1mL，4℃闭光染色30min，上机检测分析. 1.2.5免疫组化检测细胞中CyclinD1和CDK-4的表达细胞甩片经3mL L-1TritonX-100/PBS，10mL L-1H2O2/PBS处理后，正常兔血清封闭，37℃温育30min，分别滴加CyclinD1（1∶100）和CDK-4（1∶100）多抗，4℃过夜，次日晨滴加兔抗羊IgG血清，37℃温育30min，DAKO即用型二抗复合物，37℃温育30min（以上各步间均以PBS充分振洗），DAB显色，室温5min，PBS振洗中止显色反应，苏木精衬染，逐级乙醇脱水后二甲苯透明，中性树胶封片;阴性对照用PBS代替一抗，其他同前. 1.2.6免疫组化定量分析CyclinD1和CDK-4在细胞中的阳性信号为覆盖胞核、胞质的棕黄色颗粒（Fig1～4）.用免疫组化定量系统，对正常组和实验组进行测量，每次测量前，都以统一的空白片作标准，调整系统光度值，设定的标准灰度，在同一灰度条件下，避开无细胞的区域，每张切片选择5个不同的视野，用鼠标按细胞的形态画出细胞轮廓，自动测量，选平均灰度为测量指标，放大倍数为400倍.系统设定白色最大灰度为256，黑色最小灰度为0.因此，灰度值越小，代表其阳性反映程度越高. 统计学处理:对MTT检测结果和免疫组化定量分析结果所得的数据用x±s表示，以统计软件（Stat-graphics，Version3.0）进行两组间显著性方差分析，比较两组间的差异. 2结果 2.1MTT检测培养液中加入50mg L-1的EGF后，真皮成纤维细胞增殖活力增强，A490nm为（0.550±0.008），未加入EGF组A490nm值为（0.370±0.0