EphrinA1基因小干扰RNA的构建及其在Huh.docVIP

　　EphrinA1基因小干扰RNA的构建及其在Huh 王怡，陈钢，陈必成，刘佳明，黄陈平 【摘要】 目的 ：构建针对EphrinA1基因的发夹状RNA（ShRNA）表达载体pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA，观察其对人肝癌细胞Huh-7中EphrinA1基因表达的特异性抑制效应。方法 ：设计合成针对EphrinA1 mRNA的RNAi核苷酸片段，并定向克隆到pSilencer2.1-U6载体中，构建重组质粒pSilencer2.1-EphrinA1- SiRNA.freelRNA表达较pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA组和空白对照组明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA载体的成功构建为下一步研究以EphrinA1基因为靶位点的肝细胞癌基因治疗奠定了重要的实验基础。 【关键词】 EphrinA1；小干扰RNA；肝细胞癌 Abstract: Objective: To observe the inhibition effect of ShRNA on EphrinA1 expression in hepatoma cell line Huh-7 through construction of the expressed carrier pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA of EphrinAI. Methods: TRNA sequence in GenBank，and then ids to create rebinant plasmids pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA and pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA (control). After being transfected into Huh-7 cells，EphrinA1 expressed by ShRNAs ids ids ids (P＜0.05）. Conclusion: Con-struction of pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA lays an important experimental foundation for gene therapy of hepatocellular carcinoma (HCC) by targeting the EphrinA1 gene. Key bion公司；T4连接酶及各种限制性核酸内切酶均购自美国Promega公司；脂质体Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；质粒提取试剂盒、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购自TaKaRa公司；RT-PCR引物由上海生工合成。 1.2 EphrinA1-siRNA转录模板的发夹结构设计 将EphrinA1的mRNA全序列（GenBank NM_ 004428）输入到SiRNA Sepuence Selector中，筛选出一个19 nt的靶序列，阴性对照将SiRNA片段顺序打乱。SiRNA靶序列为5’-ACCACAGGCAT AAGCTATC-3’，Scramble SiRNA靶序列为 5’-CA CACCATAATAAGGGTCC-3’。然后用SiRNA Hairpin Oligonucleotide Sequence Designer 软件设计成能与pSilencer2.1载体相连接的双链发夹结构。 序列结构为BamHI+sense+loop+antisense+终止信号+SalI+Hind III。 实验组DNA模板序列为： 5’-ACCACACCACAGGCATAAGCTATCTTCAAGAG AGATAGCTTATGCCTGTG GTTTTGCAATTCACAGCTT-3’ 3’-TGGTGTGGTGTCCGTATTCGATAGAAGTTCT CTCTATCGAATACGGACACCAAAACGTTAAGTGTCGAA-5’ 阴性对照组DNA模板序列为： 5’-ACCACACCACGAGCATAAGCTATCTTCAAGAG AGATAGCTTATGCTCGTGGTTTTGCAATTCACAGCTT-3’ 3’-TGGTGTGGTCTGCGTATTCGATAGAAGTTCTC TCTATCGAATACGGCCACAAAAACGTTAAGTGTCGAA-5’ 交由上海博亚公司合成。 1.3 插入片段的退火和连接 将合成的寡核苷酸链溶解在ddH2O中，各取1μL正义和反义寡核苷酸链溶液，再加入48μL退火缓冲液，充分混匀，配制成50μL溶液，在PCR仪上95 ℃孵育4 min，70 ℃孵育10 min，缓慢冷却至4 ℃