FasL mRNA在椎间盘细胞中表达的分布论文.docVIP

　　FasL mRNA在椎间盘细胞中表达的分布论文 司春祥 陈伯华 吕振华 【摘要】 目的 观察凋亡相关基因FasL mRNA在椎间盘细胞中表达的分布。方法 收集胎儿及成人病理腰椎间盘髓核标本，PHAP激活单个核细胞诱导FasL表达，提取总RNA，RTPCR制备FasL基因片段。定向克隆入质粒载体pSPT19多克隆位点构建重组质粒，体外转录制备DigFasL cRNA探针。cRNA探针原位杂交进行FasL mRNA表达分布的观察。结果 克隆化FasL序列经DNA测序准确无误，体外转录cRNA探针标记效果满意；胎儿腰椎间盘组织脊索细胞、软骨样细胞中可检测到FasL mRNA的较高杂交信号，成人突出椎间盘细胞中罕见正常细胞，未检出FasL mRNA信号。结论 FasL基因在胎儿期腰椎间盘细胞内表达.freelRNA in intervertebral disc. Methods Nucleus gelatinosus specimens fetus and pathologic disc. PBMC the actived PBMC. A fragment of FasL gene plified from total RNA using onestep RTPCR. PCR product id pSPT19 RNA bar intervertebral disc specimens using in situ hybridization. Results The inserted FasL cDNA fragment in pSPT19FasL RNA signals erged in both notochord cells and chondrocytelike cells in the nucleus of fetal discs. Conclusion The FasL mRNA bar intervertebral disc cells, and apoptosis occurred early. In adult, the quantity of intervertebral disc cells reduced, the metabolism of them decreased, and the expression of FasL mRNA could not be detected. ［KEY 109、EasyHyb、分子克隆所用试剂盒、工具酶及所用仪器设备由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供。 1.2 标本来源 收集胎龄＞5月的胎儿及手术取出的椎间盘髓核标本10例，置无菌EP管中液氮速冻后-70 ℃保存。10例病人中,男6例,女4例;年龄32～65岁,中位年龄50岁;病程6月～5年，平均1.4年。L4,5者5例，L5S1者4例。 1.3 引物设计 引物依FasL mRNA序列（NM_000639.1）设计，其上游、下游引物分别来自mRNA序列。PCR产物长334 bp。上游引物的5′端修饰PstⅠ酶切序列，下游引物5′端构建EcoRⅠ酶切位点，CTC保护。引物由北京华美公司合成。上游引物:5′CTCCTGCAGGCCCTTCAATTACCCATATCCC3′，下游引物:5′CTCGAATTCGAGTTCTGCCAGCTCCTTCTGT3′。 1.4 人Fas L 基因片段的克隆化 1.4.1 FasL基因的诱导表达及总RNA的制备人全血1 mL，100 g/L的EDTA抗凝;分离单个核细胞，加入50 mmol/L PHAP 37 ℃激活15 min;然后37 ℃孵育1 h，QIAamp RNA blood Mini kit提取总RNA。 1.4.2 cDNA的合成 按照QIAamp RNA Blood Mini kit说明，在反应混合液中加入下列试剂：5×Buffer 10 μL；10 mmol/L dNTP 2.0 μL；5×Q液10 μL；上、下游引物各0.6 μmol/L；RTPCR 酶复合物2.0 μL；Rnasin 30 U；总RNA 1 μg（经70 ℃温育5 min）,.freelin；然后95 ℃ 15 min, 94 ℃ 1 min,52 ℃1 min,72 ℃ 1 min,共40个循环;最后72 ℃延伸10 min。QIAquick Gel Extraction kit进行胶上PCR产物回收。 1.4.3 PCR产物的克隆 PCR产物和质粒载体pSPT19分别进行EcoRⅠ、PstⅠ双酶切，15 ℃下T4连接酶连接反应16 h。转化感受态大肠杆菌JM109（CaCl2法制备），氨苄青霉素抗菌及PCR快速筛