FasL反义寡核苷酸逆转肝癌细胞免疫逃逸 的实验研究论文.docVIP

　　FasL反义寡核苷酸逆转肝癌细胞免疫逃逸 的实验研究论文 张娇 刘倩 王杰 毛海婷 【摘要】目的：研究FasL反义寡核苷酸对肝癌细胞Fas/FasL途径免疫逃逸的逆转作用。方法：用流式细胞术检测肝癌细胞系HepG2.2.15细胞表面Fas、FasL的表达及Jurkat细胞表面Fas的表达；用HepG2.2.15细胞与Jurkat细胞共培养方法，研究FasL诱导T细胞凋亡的功能；用脂质体介导法转导FasL反义寡核苷酸入肝癌细胞，并通过检测细胞表面FasL表达、RTPCR及细胞共培养方法研究FasL反义寡核苷酸转导对肝癌细胞免疫抑制的逆转作用。结果：①HepG2.2.15细胞低表达Fas，却表达有功能的FasL，与高表达Fas的Jurkat细胞共培养可诱导后者凋亡；②肝癌细胞转入FasL反义寡核苷酸后，FasLmRNA降低；细胞表面FasL表达下降；与Jurkat细胞共培养，Jurkat细胞的凋亡率下降。结论：肝癌细胞表达的FasL可抑制T细胞的免疫功能，是肝癌细胞免疫逃逸的重要机制之一；FasL反义寡核苷酸转导可以逆转肝癌细胞的免疫抑制作用。 【关键词】肝肿瘤 Fas/FasL 免疫逃逸 寡核苷酸类.freelmune escape in hepatocarcinoma cell line 【ABSTRACT】Objective:To investigate the reverse action of FasL antisense oligonucleotide on the immune escape through Fas/FasL patha cells.Methods:Fas、FasL expression of hepatocarcinoma cell line HepG2.2.15 and Fas expression of Jurkat cell ined by floetry.FasL function of inducing Tlymphocytes to apoptosis a cells HepG2.2.15 and Jurkat cells.The hepatocarcinoma cells ediated by lipofectin.The reverse action a cells RNA,the rate of FasL expression and the apoptotic rate of Jurkat cells in coculture assays all decreased.Conclusion:FasL expressed by the hepatocarcinoma cells could inhibit the immune function of Tlymphocytes.It portant mechanisms of immune escape in hepatocarcinoma cells.FasL antisense oligonucleotide could reverse the action of immune inhibition. 【KEY Reagent,为美国Invitrogen公司产品。TRIzol Reagent、Reverse Transcriptase、Taq DNA polymerase等RTPCR用试剂，均购自上海生工生物工程技术公司，引物及FasL反义、正义寡核苷酸（SODN），由上海生工生物工程技术公司合成。 1.2 细胞培养 人肝癌细胞株HepG2.2.15及Jurkat细胞由中国医学科学院提供。HepG2.2.15细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中；Jurkat细胞培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中。37℃、5%CO2、饱和湿度下培养。 1.3 流式细胞术（FCM）检测肝癌细胞表面Fas、FasL表达及Jurkat细胞表面Fas表达 收集正常生长的HepG2.2.15细胞及Jurkat细胞，PBS洗两次，分别加入1∶30稀释的兔抗人Fas、FasL抗体，用PBS代替一抗作阴性对照，4℃反应30min；PBS洗一次，加入1∶90稀释的FITC标记的羊抗兔IgG抗体，4℃避光反应30min，PBS洗一次，加入PBS 500μl，上机检测。 1.4 肝癌细胞FasL功能检测 HepG2.2.15细胞2×106/孔接种至6孔培养板，培养至细胞密度达80%以上时，去除培养液并冲洗板孔。实验组（A组）：HepG2.2.15细胞加入Jurkat细胞4×105/孔；NOK2处理组（B组）：HepG2.2.15细胞加入10μg/ml的FasL中和抗体NOK2 400μl，孵育1h后加入与A组等量Jurkat细