FXR1P与Btf相互作用的鉴定-论文.docVIP

　　FXR1P与Btf相互作用的鉴定*论文 .freelids from the blue clones，ed cDNA library in yeast t. And transform them into E.coli Top10 and select transformants p+ plates. Then culture the transformants and extract the AD/library plasmids，ed into Y187 for ninimating ed ay be the gene Btf. Conclusion There exists the interaction betental retardation 1，FMR1），其编码蛋白FMRP的缺失或低表达导致疾病的发生。1995年Zhang Y 等［2］克隆出两个定位于常染色体（3q28和17p13.1）、与FMR1基因非常相似的基因，命名为脆性X相关基因1（FXR-1）和脆性X相关基因2（FXR-2），分别编码FXR1P和FXR2P，它们和FMRP有较高的同源性。有学者运用酵母双杂交体系、免疫亲和层析以及基质辅助的激光解吸电离质谱方法，相继发现了一些FMRP相互作用蛋白，包括脆性X相关蛋白FXR1P和FXR2P、核仁素、核FMRP相互作用蛋白（nuclear FMRP interacting protein，NUFIP）、核糖体蛋白、泛素结合酶9（ubiquitin-conjugating enzyme 9，UBC9）、胞浆FMRP相互作用蛋白（cytoplasmic FMRP interacting proteins，CYFIP）、核苷酸二磷酸激酶亚基B、T/G错配糖苷酶（T/G mismatch-spicific DNA thymine glycosylase，TDG）、82-FIP（82-kD FMRP interaction protein）［3～5］。FXR1P是否也与这些蛋白发生相互作用？还与其他哪些蛋白发生相互作用呢？故筛选并研究FXR1P的相互作用蛋白，不但可以初步了解其功能，还可以为脆性X综合征的发病机制提供新的依据。本文通过进一步验证酵母双杂交文库筛选过程中得到蓝色克隆，确认FXR1P和Btf的相互作用，为FXR1P下一步的功能研究奠定基础，为脆性X综合征发病机制的研究提供新的依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌Top10实验室保存，酵母菌株Y187和AH109购自Clontech公司；质粒pGBKT7和pGADT7购自Clontech公司。 1.1.2 主要试剂 酵母SD培养基，SD/-His/-Leu/-Trp，SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基，X-β-半乳糖苷（X-gal）等购自Clontech公司；醋酸锂购自Sigma公司；其他试剂均国内购买。 1.2 方法 1.2.1 蓝色克隆文库质粒的分离 通过文库筛选我们已经得到了一些蓝色克隆，利用Lyticase酶裂解法提取蓝色克隆的酵母质粒，CaCl2法转化感受态Top10，铺在LB/Amp板上，以阳性菌落提取提取质粒。 1.2.2 酵母感受态的制备 挑Y187单克隆至1ml YPDA液体培养基中，高速振动打散细胞，并将此含有酵母单克隆的YPDA液体培养基转入50ml YPDA 液体培养基中，30℃，230rpm，孵育18～24h，至OD600≥1.5；再将此培养基倒入400ml YPDA 液体培养基中使OD600=0.2-0.3，30℃ 230rpm，振摇至OD600=0.5±0.1；转移此菌液至50ml离心管中，于室温1000×g转速下离心5min，弃上清，无菌TE重悬细菌沉淀；再次离心弃上清后，用新鲜制备的无菌的1×TE/1×LiAc重悬细菌沉淀，准备做转化。 1.2.3 感受态酵母细胞的转化 在每支1.5ml EP 管中加入0.1μg AD/Library 质粒和0.1mg鲑精DNA，混匀；加入0.1ml酵母感受态细胞，振荡充分混匀；加入0.6ml 无菌PEG/LiAc 溶液，高速震荡10s；30℃ 200rpm振摇30min；加70μl DMSO，颠倒混匀；42℃热休克15min，立即置冰浴1～2min；室温14000rpm离心5s，弃上清，0.5ml无菌1×TE缓冲液重悬细菌沉淀；取0.1ml铺亮氨酸缺陷培养基（SD/-Leu）平板上，筛选所需的AD/Library/Y187。 1.2.4 一对一酵母配合 挑取AD/Library/Y187和pGBKT7/FXR1/AH109单克隆同时置于装有0.5mlYPDA培养基的EP管里，震荡充分重