Eag1钾离子通道在宫颈癌中的表达以及缺氧对其的调控论文.docVIP

　　Eag1钾离子通道在宫颈癌中的表达以及缺氧对其的调控论文 林爽，李力,刘媛,李书林 【摘要】 目的 研究不同病变宫颈组织中Eag1表达情况以及缺氧对宫颈癌Hela细胞膜上Eag1钾离子通道表达和活性的影响。方法 采用免疫组化法检测不同宫颈组织和宫颈癌Hela细胞中Eag1蛋白的表达情况;采用RT-PCR法检测不同缺氧时间和缺氧浓度对Hela细胞中Eag1 mRNA表达的影响。采用全细胞膜片钳记录的方法，研究缺氧对Eag1钾离子通道活性的影响。结果 宫颈上皮内瘤变组织中Eag1蛋白的表达明显高于正常组，宫颈癌组织中Eag1的表达明显高于宫颈上皮内瘤变组;Eag1的表达随临床分期的增加逐渐增高，Eag1的表达与病理分级无明显相关性。正常培养的宫颈癌Hela细胞中即有Eag1表达;其表达随缺氧程度加深及缺氧时间的延长明显增强。Hela细胞中Eag1钾离子通道是电压依赖性的，具有延迟整流及不失活特性;轻度缺氧条件能使Hela Eag1钾离子通道电流强度增大、激活时间缩短。结论 Eag1钾离子通道蛋白有可能成为新的早期筛查和判断宫颈癌生物学行为的诊断指标。 【关键词】 宫颈癌;钾离子通道;Eag1 Abstract Objective Immunohistochemistry ployed to detect the expression of Eag1 protein in different cervix uteri tissues and CACX Hela cells.Methods eanp recording ployed to investigate the effect of hypoxia on activity of Eag1 K+ channel.Results The expression of Eag1 protein in cervical intraepithelial neoplasia (CIN) tissue al control, and the expression in CACX tissue arkably higher than that in CIN group. The expression of Eag1 ascended as the development of clinical stage of cervical cancer, but almost irrelevant to pathological grade. Results of immunofluorescence and RT-PCR suggested that the expression of Eag1 significantly increased along e. eanportant role in hypoxic reception of CACX Hela cell. Key channels; Eag1 宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，虽然目前诊疗技术有了较大的提高，但仍有30%～40%的患者死于局部复发和远处转移。 研究表明组织缺氧是导致肿瘤发生、发展.freelin流量充入密闭容器，持续20min，同时关闭进气口和出气口，抽取气体经血气分析仪检测容器内O2浓度小于5%。 1.3 Eag1表达的检测 1.3.1 免疫组化检测方法 兔抗人Eag1单克隆抗体购自sigma公司。组织标本常规石蜡包埋，制成4μm厚切片，常规脱蜡，30%新鲜双氧水灭活内源酶，将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，微波炉加热至沸后断电,间隔10min重复两次,冷却后0.02M PBS洗涤,抗原修复液修复抗原,山羊血清封闭后不洗,滴加1:150稀释的Eag1单克隆抗体,.freelin后,DAB显色,苏木素轻度复染,二甲苯透明,封片。显微镜下观察并计数阳性染色细胞数。 1.3.2 判断标准 Eag1主要定位于胞浆和(或)胞膜。根据肿瘤细胞显色的比例及染色强度，对Eag1表达做半定量评定3。按阳性细胞率评分：阳性细胞数占 11%为1分; 11%～50%为2分; 51%～80%为3分; 80%为4分。按显色程度评分:染色弱为1分;中等染色为2分;强染色为3分。然后将两种评分结合起来分为4级:无论染色强度如何,细胞阳性率≤10%为阴性;评2或3分者为弱阳性(+);评4或5分为中度阳性(++);6或7分为强阳性(+++)。若1例标本有2个染色结果,则取1个纳入统计。 1.4 RT-PCR法检测低氧对Eag1 mRNA表达的影响 Trizon试剂盒购自Invitrogen 公司，反转录试剂盒购自TaKaRa公司。Eag1引物为：5-TAATGGCTTCCCTCTTTCATCTCCT-3;5-TGTTG