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　　ECM修复兔桡骨缺损的实验研究论文 【摘要】 研究自制的兔耳廓脱细胞软骨基质（extracellular cartilage matrix，ECM）修复骨缺损的特点及机理。［方法］采用新西兰大白兔共40只，随机分A、B两组，在其两侧桡骨干中段制作5 mm的骨缺损模型。右侧作为实验侧，缺损区A组植入脱细胞软骨基质复合自体培养骨髓干细胞，B组仅植入脱细胞软骨基质，左侧为空白对照。分别于2、4、6、10周处死动物，标本行放射学及组织学检查。［结果］X线及组织切片均证实复合体在6周时已有致密骨组织形成.freelechanism of the bone defect repair atrix（ECM）:A and B on the right side,the defect esenchymal stem cells（MSCs）,the ECM in the groups A and B,respectively.The defects on the left side served as controls correspondingly.The rabbits ples ental sides the bone defects embranous ossification and entochondrostosis.［Conclusion］It is suggested that the plex of ECM and autologous MSCs has the effects on guiding bone regeneration and preventing from nonunion. Key atrix（ECM）; chondrocyte 临床上长段骨缺损造成的骨不连较常见。骨缺损的修复材料很多，自体骨移植修复效果虽理想，但其来源有限。如何选择一种材料来提高骨缺损修复效果，这是人们正在研究的重点。作者采用经胶原酶-去垢剂处理，去除抗原性成分的兔耳廓软骨复合自体软骨细胞植入兔桡骨干缺损，分别于2、4、6、10周观察骨的修复能力。具体报告如下。 1 材料和方法 1.1 材 料 新西兰大白兔（购自华中科技大学同济医学院动物试验中心），共40只，均为雄性，月龄为2~3个月，体重2.0~2.5 kg。 1.2 兔耳廓ECM的制备 切取2月龄兔的双侧耳廓，去除皮肤及软骨膜，新鲜软骨用PBS液冲洗3遍，采用去垢剂酶四步法〔1〕对软骨进行脱细胞处理：（1）将新鲜软骨置入Tris低渗缓冲液中，缓冲液中含有蛋白酶阻断剂，4 ℃恒温震荡48 h；（2）1％TritonX100、Tris缓冲剂抽提48 h后，以蒸馏水连续冲洗24 h；（3）DNase Ⅰ和RNase Ⅰ混合后，在37 ℃下消化2~4 h：（4）再次用1％TritonX100、Tris缓冲剂抽提48 h，取出后所有标本用DHanks生理盐溶液4 ℃下彻底清洗24~48 h。完成了对软骨脱细胞处理后，置于无菌PBS液中保存备用。 1.3 骨髓干细胞的分离和培养 按Kadiyala等〔2〕描绘的方法，取健康2个月龄新西兰大白兔，氯胺酮和异丙嗪肌注麻醉，双侧髂部剪毛后碘伏消毒，在无菌条件下用16号骨穿刺针在髂骨翼外侧穿入骨髓腔，注射器针管内预先含有0.1 ml肝素钠生理盐水，抽吸骨髓液6 ml移入Mc5A培养液5 ml的离心管内混匀，1 500 r／min离心5 min，弃上层脂肪和上清。加入适量无血清培养液悬浮细胞，缓慢移入盛有比重为1.077淋巴细胞分离液的离心管中（细胞培养液与细胞分离液之比1∶1），以2 000r／min离心20 min，小心吸取界面的有核细胞乳白层，加入Mc5A培养液10 ml，制成细胞悬液移入25 cm2培养瓶中，置于37 ℃ 5％CO2及饱和湿度培养箱中培养，倒置显微镜下观察呈形态一致的均质的分布均匀的细胞，可用于MSCs收集和移植〔4、5〕，计数每瓶中含有细胞1.5×105个／ml时，收集的骨髓MSCs低温存储中。 1.4 动物模型的制备 2~3个月龄的新西兰大白兔40只，均为雄性，体重2.0~2.5 kg，随机分为2组，每组20只，在其双侧桡骨中段，咬去5 mm桡骨造成骨缺损模型，右侧作为实验侧，左侧为空白对照，A组中右侧缺损区植入脱细胞软骨基质复合自体培养软骨细胞，B组仅植入脱细胞软骨基质，分别于2、4、6、10周处死动物，标本行放射学及组织学检查。 1.5 放射学检查 术后第4、6、10周分别于同样条件下拍X线片观察骨缺损修复情况。因为ECM不显影，如果出现密度增高影即表示有新骨形成。对12周的X线片根据骨缺损内生骨面积行X线等级疗效评估〔3〕。100％为5分，75%~99％为4分，50%~74％为3分，25