EB病毒LMP1基因靶向shRNA表达载体构建方法的比较研究论文.docVIP

　　EB病毒LMP1基因靶向shRNA表达载体构建方法的比较研究论文 【关键词】 疱疹病毒4型,人；RNA干扰；遗传载体 parative study betethods of short hairpin RNA expression vector targeting EpsteinBarr virus LMP1 gene 【Abstract】 AIM: To explore the differences betethods of short hairpin RNA expression vector targeting EpsteinBarr virus(EBV) latent membrane protein1(pshLMP1), so as to look for a more stable and convenient ethod or PCR method, and the differences of constructive strategies, construction processes and sequencing results betethods ethods but better cloning efficiency ethod utation. CONCLUSION: PCR method is a more efficient ore stable pshLMP1 expression vector. 【Keyan; RNA interference; geic vectors 【摘要】 目的： 探讨两种构建EB病毒LMP1 基因的shRNA表达载体(pshLMP1)方法的不同，寻找更加稳定方便的靶向shRNA表达载体的构建方式. 方法： 设计针对EB病毒LMP1基因的特异siRNA 编码序列，分别应用传统的双链退火法和新颖的双链PCR法构建pshLMP1，比较两种方法在设计原则、构建方法和鉴定结果上的不同. 结果： 两种方法均能得到pshLMP1重组质粒，但是双链PCR法构建效率高且不易引起碱基的缺失和突变. 结论：双链PCR法构建EB病毒pshLMP1表达载体比传统双链退火法更加稳定，构建成功率较双链退火法高. 【关键词】 疱疹病毒4型，人；RNA干扰；遗传载体 0引言 应用RNA干扰技术阻断EpsteinBarr病毒LMP1基因(EBVLMP1)的表达已成为鼻咽癌基因治疗的研究方向之一. 常用的RNA干扰表达载体构建方法为双链退火法，但是由于DNA寡核苷酸单链片段长度在60~70 bp左右.freelRNA和cDNA序列从GenBank搜索. pTZU6+1载体由重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室保存提供，内含有人U6启动子，能在体内转录产生RNA链，含XbaI和SalI克隆位点. DNA寡核苷酸链由上海英骏生物技术有限公司合成. Taq DNA聚合酶，dNTPs及相应buffer,限制性内切酶SalI, XbaI及相应buffer，T4连接酶均购自Takara 公司. 其余试剂均为自行配制. DNA测序工作由重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室完成. 1.2方法 1.2.1选择EBVLMP1基因靶位点EBVLMP1 cDNA序列由exon a, b, c三个外显子组成. 在exon c中第747920位碱基中有多个内部重复序列，长度为35 bp： GTCCTGGGACTGTTGTGACTACTGTTACCGGGTGT. 根据siRNA设计原则，选择该重复序列中第323位的21个碱基为靶位点，设计EBVLMP1基因靶向RNA干扰表达载体(pshLMP1). 1.2.2双链退火法构建pshLMP1 1.2.2.1按照图1的策略构建合成DNA寡核苷酸单链其中21nt coding sequence为拟沉默的EBVLMP1靶基因序列. 图1双链退火法构建pshLMP1策略（略） 1.2.2.2退火，构建、鉴定pshLMP1重组质粒取等量100 mmol/L的DNA寡核苷酸单链片段混合，在退火缓冲液（100 mmol/L NaCl）中95℃加热5 min，缓慢降至室温，乙醇沉淀法纯化DNA双链，25 g/L琼脂糖电泳鉴定. 双链DNA片段与用SalI和XbaI双酶切的转录载体pTZU6+1进行连接，转化大肠埃希杆菌JM109，Amp抗性筛选，阳性克隆进行菌液PCR鉴定，并测序鉴定插入序列正确与否. 1.2.3双链PCR法构建pshLMP1 1.2.3.1按照图2的策略构建合成EBVLMP1 PCR引物其中两条引物间3′端以10个碱基互补配对（pairing bases）为佳，21nt coding sequence为拟沉默的EBVLMP1靶基