HLAB-2705重链的原核表达和活性鉴定论文.docVIP

　　HLAB*2705重链的原核表达和活性鉴定论文 李彦博，孙玉英，郭斯启，孙业平，张秀云，孔繁华，奚永志 【摘要】 本研究探讨HLAB*2705重链的原核表达及活性鉴定。从HLAB*2705全长cDNA中PCR扩增出膜外区片段并克隆进入pGEMT载体，序列测定后构建原核融合表达载体pET32a（+）B*2705.freel and identify its activity, the extramembrane gene fragment of HLAB*2705 plified from fulllength HLAB*2705 cDNA by PCR and cloned into pGEMT vector. After identification by sequencing, the prokaryotic expressing vector pET32a（+）B*2705 ore than 50% of the total bacteria protein. The antigenic activity of expressed protein ed by （DE3）购自Novagen公司。Tag DNA 聚合酶、pGEMT载体连接试剂盒和质粒提取试剂盒购自Promega公司，DNA回收试剂盒购自LST公司， 小鼠抗人B*2705单克隆抗体购自Serotec公司，碱性磷酸酶标记羊抗小鼠IgG二抗试剂盒及NBT/BCIP显色试剂盒购自华美公司。 引物的设计和合成 PCR扩增引物：上游5′GAATTCGGCTCCCACTCC ATGAGG3′（含Nco I酶切位点）；下游5′GCGCG CCGCTTACCATCTC3′（ 含Not I酶切位点）。上述引物由上海生工生物工程公司合成。 cDNA获得 本室保存有HLAB*2705全长cDNA，已经测序鉴定。PCR扩增：95℃ 预变性10分钟；96℃变性 1分钟，55℃退火 1分钟，70℃延伸 2分钟；共26个循环。DNA回收按试剂盒说明书进行。DNA片段插入T载体参照pGEMT载体连接试剂盒说明书进行。 重组子的挑选、酶切和测序鉴定 将连接产物转化DH5α感受态菌，以IPTG、Xgal氨苄琼脂糖平板筛选，挑取白色克隆培养过夜，小量提取质粒进行Nco I和Not I双酶切鉴定。鉴定的阳性克隆送TaKaRa公司测序。 pET32a（+） B*2705表达载体的构建 将测序鉴定正确的克隆，扩增并提取质粒。以Nco I 和Not I 双酶切并回收DNA片段。pET32a（+）空质粒也同样处理。DNA连接酶连接回收产物。将连接产物转化DH5α感受态菌，以氨苄琼脂糖平板筛选，挑取阳性克隆培养过夜并提取质粒进行Nco I和Not I双酶切鉴定。 重组子诱导表达 鉴定构建正确的表达载体转化origamiTM（DE3）感受态菌，并以卡那霉素、四环素、氨苄三抗琼脂糖平板筛选，挑选阳性克隆进行IPTG诱导表达。诱导方案：从三抗平板上挑选一克隆接种M9培养基过夜；按1∶100接种三抗M9丰富培养基，37℃摇床 250转/分钟，约3.5小时；至OD600=0.5-0.7时，加入IPTG至终浓度0.5-1 mmol/L，37 ℃摇床震摇5小时，收菌。或者，按1∶100接种后在37 ℃下培养5小时以上，至OD600 = 0.8-1.0后，将温度降至22 ℃，加入IPTG，继续培养过夜，收菌。 表达产物的SDSPAGE电泳和： DNA marker. Lane 1: HLAB*2705 表达载体的酶切鉴定 pET32a (+)/B*2705阳性克隆质粒NcoI/NotI 双酶切，获得约960 bp的B*2705的插入片段（图2）。上述表达载体是在测序正确后构建的。 诱导表达的结果 pET32a (+)/B*2705全菌在37℃及22℃诱导表达后，经变性10% SDSPAGE结果分别见图3A和3B。在47 kD处可见一诱导表达条带。B*2705胞外区共315个氨基酸，经预测分子量大约为34.7 kD，加上融合表达的硫氧还蛋白的分子量12 kD，预期分子量大约为46.7 kD，这与我们的结果基本吻合。经凝胶扫描软件分析，在37℃及22℃诱导所得的产量分别为53.1% (图3A) 和52.4% (图3B)。 Figure 2. Double restriction of pET32 a (+)B*2705 expression vector.M: DNA marker. Lane 1 and 2: HLAB*2705. Figure 3. SDSPAGE of total bacteria protein induced