KDR siRNA对乳癌细胞凋亡和NES1与RUNX3基因甲基化影响论文.docVIP

　　KDR siRNA对乳癌细胞凋亡和NES1与RUNX3基因甲基化影响论文 许秀娥 徐宏伟 葛银林 张金玉 冯翠萍 【摘要】 目的 探讨体外水平利用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)敲减含激酶插入区受体(KDR)基因治疗乳癌的可行性和特异性。方法 采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000TM作为转染试剂,将针对人KDR基因的siRNA转染人乳癌细胞株MCF7敲减KDR基因的表达。通过Hoechst 33258染色观察MCF7细胞的凋亡情况;采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测NES1基因和RUNX3基因甲基化状态和mRNA的转录水平。结果 靶向KDR的siRNA转染MCF7细胞后可诱导细胞凋亡，NES1基因和RUNX3基因甲基化程度降低，出现非甲基化条带，同时mRNA表达上调。结论 KDR siRNA在体外能逆转MCF7细胞的NES1基因和RUNX3基因甲基化，并诱导细胞凋亡。 【关键词】 RNA干扰;MCF7细胞;血管内皮生长因子受体2;甲基化;细胞凋亡 ABSTRACT Objective To investigate the feasibility and specificity of gene therapy for breast cancer by using KDR gene expression through chemically modified siRNA in vitro. Methods The siRNA e Lipofectamine 2000TM to knockdoeasured by Hoechst 33258 staining; methylation specific PCR (MSP) assay ethylation status of NES1 and RUNX3 gene; the expressions of mRNA of NES1 and RUNX3 gene erase chain reaction (RTPCR). Results siRNA directed against KDR induced the apoptosis of MCF7, loethylation, the unmethylation appeared, and, meanRNA. Conclusion KDRsiRNA can, in vitro, reverse the methylation of NES1 and RUNX3, and induce apoptosis. KEY CF7 cells; vascular endothelial groethylation; apoptosis 恶性肿瘤生长过程中，肿瘤组织内血管的再生是肿瘤组织内细胞急剧、持续性增殖的病理生理学基础。有研究认为，含激酶插入区受体(KDR)，即血管内皮生长因子受体2(VEGFR2) 是血管内皮生长因子(VEGF)发挥功能的主要受体.freelRNA而起作用，特殊设计的小干扰RNA(siRNA)能使靶基因发生特异性沉默2。前期研究显示，KDR siRNA转染乳癌细胞株MCF7后可抑制细胞增殖。本研究旨在进一步探讨其对MCF7细胞凋亡的诱导作用和对抑癌基因甲基化的影响，为其应用于临床提供理论和实验依据。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株 人乳癌细胞株MCF7购自中国协和医科大学基础学院细胞中心。常规培养于含体积分数0.10胎牛血清的DMEM(GIBCO公司产品)培养液中，置于含体积分数0.05的CO2、37 ℃饱和湿度的孵箱中培养传代。 1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、Lipofectamine 2000TM及Trizol Reagent由Invitrogen公司生产;AMV逆转录试剂盒由Bioer公司提供;细胞凋亡Hoechst染色试剂盒(c0003)为Beyotime公司产品;基因组DNA修饰试剂盒由Zymo公司提供。 1.2 siRNA设计合成 根据文献3确定KDR siRNA序列,其正义链为5′GCCACCAUGUUCUCUAAUATT3′，反义链为5′UAUUAGAGAACAUGGUGGCAT3′;阴性对照siRNASCR序列正义链为5′UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3′，反义链为5′ACGUGACACGUUCGGAGAATT3′。两段siRNA序列均行BLAST对比确保与其他基因没有同源性。为增强siRNA的稳定性，对正义链进行甲基化修饰，反义链不修饰，并由上海吉玛制药技术有限公司合成。 1.3 转染 根据Lipofectamine 200