Müller细胞对大鼠视网膜微血管内皮细胞增生和迁移的影响论文.docVIP

　　Müller细胞对大鼠视网膜微血管内皮细胞增生和迁移的影响论文 郭斌，王应利，惠延年，王雨生，马吉献 【摘要】 目的：用免疫磁珠法原代培养大鼠视网膜微血管内皮细胞(RMEC)，观察共培养Müller细胞对视网膜微血管内皮细胞增生和迁移的影响。方法：采用免疫磁珠的细胞分选法分离大鼠视网膜微血管内皮细胞，在条件培养基中培养生长，采用第Ⅷ因子抗体免疫组化染色方法鉴定细胞.freelL/L 胎牛血清〔（Fetal Bovine Serum, FBS），杭州四季青〕的DMEM（Gibco），100g/L链霉素，100kU/L青霉素，55kU/L肝素（Sigma），75g/L内皮生长添加剂〔（endothelial cell groent, ECGS），Sigma〕，小鼠IgG免疫磁珠（直径4.5±0.2μm，Dynal Biotech）100 μL，用无血清的DMEM清洗3遍，然后加入小鼠抗大鼠PECAM-1 mAb（1g/L，Chemicon）10μL 4℃包被过夜。包被后的磁珠用含有100mL/L FBS清洗3～6遍，悬浮磁珠。 1.2方法 1.2.1 RMEC的培养和鉴定 RMEC分离培养采用改良Hein取出，解剖显微镜（Stemi V6, Zeiss）下无菌操作取出30只视网膜。将视网膜收集在一起，用PBS冲洗，再置于培养皿中剪成小块，再置于1g/L的Ⅰ型胶原酶（Sigma，采用无血清的DMEM配制）5mL中37℃消化30min，过双层的53μm尼龙筛网（上海德华金属网带有限公司），收集滤液离心（400g）10min，弃上清，使用含有100mL/L FBS中和，吹散细胞，400g离心10min，弃上清液。加入100mL/L FBS 1.5mL吹打使细胞悬浮，加入抗体包被的免疫磁珠，4℃孵育30min，紧密结合后，置于磁珠分离装置（MCP-1, Dynal）上用100mL/L FBS洗涤结合磁珠的细胞6次，将细胞接种于明胶包被的培养板中，加入培养液。细胞培养箱（Heraeus）环境为37℃、50mL/L CO2、950mL/L 空气，细胞扩增传代采用2.5g/L胰酶（Gibco）和0.2g/L 乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)（1∶1）混合消化液(TE)。将已消毒的5mm盖玻片置于30mm培养皿中，按1×108/L细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，待细胞贴壁牢固后，PBS清洗爬片，40g/L多聚甲醛固定20min，PBS清洗，30mL/L H2O2孵育 15min。PBS清洗，封闭血清孵育20min，兔抗大鼠Ⅷ因子抗体（Zymed）在37℃孵育（湿盒）180min，阴性对照用PBS液代替一抗。PBS清洗，加入辣根过氧化物酶标记的多聚物连接兔IgG工作液37℃孵育（湿盒）30min。PBS清洗标本，DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约2～5 min，立体显微镜（Leica）观察照相。显色棕黄色为阳性表达。第6代RMEC使用含有0.4g/L EDTA的PBS溶液冲洗1次，与1mL细胞分离溶液孵育，分散细胞，细胞再用含有100mL/L FBS清洗，使用含有10mL/L山羊血清的三乙醇胺缓冲盐溶液(triethanolamine-buffered saline, TBS)封闭 20min，后与小鼠抗大鼠PECAM-1抗体在冰盒中孵育30min。阴性对照采用DMEM代替小鼠抗大鼠PECAM-1抗体。孵育后细胞用TBS/10g/L BSA清洗2次，再与FITC-小鼠IgG在冰盒中孵育30 min。染色后细胞使用TBS/10g/L BSA洗涤两次，悬浮于0.5mL TBS/10g/L BSA，使用流式细胞仪（FACS，Becton-Dickinson）分析。取第6代RMEC悬液，以4g/L台盼蓝进行细胞染色，3min内在倒置相差显微镜（Axiovert 25，Zeiss）下计数拒染细胞数，每次至少计数100个细胞，计数3次，按活细胞率=拒染细胞数/（拒染细胞数+染色细胞数）的百分数计算平均细胞存活率。 1.2.2 Müller细胞培养及鉴定 参考Reichenbach等13方法，将出生2d的EC。细胞爬片标本制作同前。PBS清洗，封闭血清孵育20min，一抗采用兔抗大鼠GFAP（Dako）和小鼠抗大鼠vimentin（Dako），在37℃孵育（湿盒）180min，阴性对照用PBS液代替一抗。PBS清洗，加入FITC-二抗工作液37℃孵育（湿盒）60min。PBS清洗标本，封片，荧光显微镜（Zeiss）观察照相。显示绿色荧光为阳性表达。 1.2.3 RMEC实验 第5～6代RMEC生长接近70%时，换去血清培养液，加入无血清培养液，继续培养24 h。取第3～4代生长状态良好