pTracer-mIFN论文.docVIP

　　pTracer/mIFN论文 张晓智，陈葳，李旭，徐海伟 【关键词】 绿色荧光蛋白 Study on biological properties of mouse embryonic stem cells modified by pTracer/mIFNγ 【Abstract】 AIM: To study the characteristics of embryonic stem (ES) cells transfected IFNγ. METHODS: The gene pTracer/mIFNγ including IFNγand green fluorescent protein (GFP) IFNγ cells by electroporation. RTPCR and ELISA icroscope to prove the GFP expression. Colony formation rates for ES/pTracer/mIFNγ cells and ES cell IFNγ cells free selective medium and nestin immunoreactive munocytochemistry. RESULTS: Green fluorescence IFNγ cells and IFNγ concentration IFNγ cells ation rates of ES cells and ES/pTracer/mIFNγ cells IFNγ cells differentiated into NPCs, odified ay not influence the proliferation, differentiation and the pluripotentiality of ES cells. 【Keybryonic stem cells; biological characteristics 【摘要】 目的: 探讨IFNγ基因转染对小鼠ES细胞生物特性的影响. 方法: 电穿孔法将pTracer/mIFNγ共表达载体转入小鼠ES细胞，荧光倒置显微镜下观测绿色荧光，RTPCR, ELISA检测转基因ES细胞IFNγ表达. 碱性磷酸酶染色，测定ES/pTracer/mIFNγ和ES细胞的细胞克隆形成率；无血清培养法诱导ES/pTracer/mIFNγ细胞定向分化为神经前体细胞（NPCs），免疫组化法检测nestin表达. 结果: 转染共表达载体pTracer/mIFNγ的ES/pTracer/mIFNγ细胞发绿色荧光.freelIFNγ细胞的集落形成率分别为73.66%和70.89%，差异无显著性. ES/pTracer/mIFNγ细胞经诱导可分化为nestin阳性NPCs. 结论: IFNγ基因转染对ES细胞的未分化特性、增殖能力及向神经系统分化潜能无明显影响. 【关键词】 干扰素γ；绿色荧光蛋白；胚胎干细胞；生物学特性 0引言 绿色荧光蛋白（green fluoscent protein，GFP）是一种在紫外光激发后能直接发出绿色荧光的蛋白质，可在异源生物中表达且无细胞毒性. GFP作为报告基因不仅可用于靶蛋白定位和功能观察，并可示踪表达GFP的细胞在动物体内的分布［1］，GFP基因整合和表达对胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）的生物学特性没有影响［2，3］. INFγ是由T细胞分泌的多功能的调节因子，早在10 a前就有利用ES细胞对IFNα和IFNβ的反应研究发育调控基因的报道［4］. 最近研究发现，IFNγ可通过直接细胞毒作用抑制胚胎生长［5］. 目前尚未见到INFγ基因转染对ES细胞生物学特性影响的报道. 我们用含GFP和IFNγ的共表达载体pTracer/mIFNγ转染ES细胞并鉴定，采用无血清培养法体外诱导ES/pTracer/mIFNγ细胞获得神经前体细胞（neural precursor cell, NPC），探讨pTracer/mIFNγ基因修饰对ES细胞增殖、分化能力等生物学特性的影响，为应用ES细胞进行的基因治疗提供实验依据. 1材料和方法 1.1材料 ES细胞株MESPU13由北京大学生命科学部提供. 含GFP和IFNγ的共表达载体pTracer/mIFNγ由中国科学院协和医院徐兴祥博士提供. DMEM/F12培养基及N2 supplement 购自Gibco公司. 多聚鸟氨酸及纤维连接蛋白购自Sigma公司. SABC试剂盒和nestin抗体购自武汉博士德公司. 质粒提取试剂盒购自Boehringer Mannheim公司. 小鼠IFNγ ELISA检测试剂盒（Endogen公司）. DN