shRNA抑制COX2基因表达对肝癌细胞HepG2生长的影响论文.docVIP

　　shRNA抑制COX2基因表达对肝癌细胞HepG2生长的影响论文 杨义明 刘预 涂植光 陈亚芹 刘靳波 【摘要】 目的： 应用RNA干扰技术抑制COX2基因，观察其对肝癌细胞HepG2生长的影响. 方法： 构建靶向抑制COX2基因表达的短发夹双链RNA(shRNA)真核表达载pshRNACOX2，转染肝癌细胞HepG2，用RTPCR和TT法检测对HepG2细胞生长的影响. 结果： 与未转染组相比，pshRNACOX2重组表达质粒抑制了HepG2细胞COX2 mRNA及蛋白表达，抑制率分别为69.9％和50.3％；并可抑制HepG2细胞生长，72 h后有统计学差异(P 0.05). 结论： pshRNACOX2重组表达载体能显著抑制肝癌细胞COX2基因表达.freela HepG2 cells. METHODS: The eukaryotic expression plasmid of short hairpin RNA (shRNA) targeting COX2 gene (pshRNACOX2) a HepG2 cells; the expressions of COX2 mRNA and protein erase chain reaction (RTPCR)and 109由本实验室保存. RPMI1640（Hyclone），新生小牛血清（杭州四季青公司产品），阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000(Invitrogen)，HindⅢ, BamHⅠ, RTPCR试剂（大连宝生物公司产品），COX2一抗（Santa Cruz产品），COX2二抗, DAB显色试剂（北京中杉公司产品）. 肝癌细胞株HepG2用含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基于37℃，50 mL/L CO2培养箱常规培养，待细胞铺满瓶底80％左右时传代. 1.2方法 将合成的单链DNA片段用退火缓冲液稀释，等摩尔混合. 94℃ 5min，缓慢降至室温形成互补双链. HindⅢ，BamHⅠ双酶切质粒pGenesil1，凝胶回收大片段线性DNA，T4连接酶4℃过夜连接，转化感受态大肠杆菌JM109, 铺含卡那霉素的LB抗性板培养16 h，挑取菌落,增菌,.freelL，接种于六孔培养板，待细胞铺满80％左右时转染. 首先用无血清无双抗RPMI 1640培养基洗涤2遍. 质粒4 μg，加无血清无双抗RPMI 1640培养基250 μL，脂质体10 μL，加无血清无双抗RPMI 1640培养基250 μL，静置5 min,将二者轻轻混匀，静置20 min，加六孔入培养板常规培养， 4～6 h换生长培养液，24 h转种培养瓶. G418筛选： 初始终浓度800 mg/L, 4 d左右大部分未转染细胞将被处死，维持终浓度400 mg/L，2～3 RNA和蛋白的检测常规胰酶消化收集细胞，冷PBS洗涤2遍，按试剂盒说明书提取细胞总RNA,逆转录成cDNA . PCR：COX2引物序列：P1：5′TTCAAATGAGAT TGT GGG AAA AT3′, P2: 5′AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT3′,扩增片段长度304 bp. 内参βactin引物序列：P1：5′GGG ACC TGA CTG ACT ACC TC3′ P2： 5′CGT CAT ACT CCT GCT TCC TG3′，扩增片段长度543 bp. PCR循环：94℃ 40 s, 55℃ 30 s, 72℃ 50 s, 38个循环. SF蛋白酶抑制剂）细胞裂解液提取总蛋白，蛋白变性上样，行100 g/L十二烷基硫酸钠－聚丙烯胺凝胶电泳，转NC膜，用50 g/L脱脂奶粉的TBST封闭2 h,加COX2多抗（1∶200），4℃过夜，TBST洗涤3次（10 min/次），二抗（1∶5000）室温2 h，洗涤3次，每次10 min，DAB显色. 数码照相. 1.2.2MTT实验检测细胞生长情况用2.5 g/L胰酶将对数期生长细胞消化下来，稀释成1×108 个/L，转种96孔板，每孔200 μL，置于37℃, 50 mL/L CO2培养箱培养，分别于24, 48, 72, 96, 168 h时，每孔加终浓度为5 g/L MTT 200 μL，继续培养3 h，终止反应. 弃去上清液，加DMSO 200 μL/孔，充分振荡10 min，酶标仪（波长570 nm）测定吸光度A值. 每组3个复孔，取其平均吸光度A值，比较个组细胞生长情况. 统计学分析：RTPCR 和TT结果采用均数±标准差表示，组间均数比较用单因素方差分析，P 0.05为有统计学意义. 2结果