中草药鉴定种特异性DNA探针的筛选方法论文.docVIP

　　中草药鉴定种特异性DNA探针的筛选方法论文 【摘要】 基因芯片技术为中草药高效、并行、快速鉴定提供了可能。而中草药种特异性探针的筛选是中草药基因芯片鉴定技术开发的关健。文章结合当今中药鉴别芯片和其它物种鉴定芯片研究进展总结了几种适合中草药特异性探针筛选的方法。 【关键词】 基因芯片； 中草药鉴别； 种特异； DNA探针 Abstract:DNA chip technology makes it feasible to identify Chinese herbal medicine rapidly, efficiently and in parallel. The screening of species-specific DNA probes from medicinal plants is the key step in developing DNA chip for the authentication of Chinese herbal medicines. bined e methods available for the screening of medicinal plants species-specific DNA probes marized in this paper. Key edicine; Species-specific DNA Probe 在中药材基因鉴别和特征性基因测序的基础上，建立以基因诊断和基因芯片为载体的中药材分子鉴别技术和方法是今后中药生物技术研究中的努力方向之一［1］。中药鉴定的基因芯片技术是指采用原位合成或显微打印手段，将中药种特异性DNA探针固定在玻璃片、尼龙膜或其它支持物表面上，形成二维DNA探针阵列，然后与荧光或DIG标记待检中药基因组DNA样本杂交，通过检测杂交信号来实现对中药的准确、并行、高效地检测。虽然DNA芯片技术已广泛应用于DNA测序［2］、单核苷酸多态性分析［3］、基因表达分析［4］、基因诊断［5］、药物筛选［6］、微生物种类鉴定等［7］各个方面，但应用于中药鉴定尚处于起步阶段，近年来随着基因芯片技术的广泛应用.freelent程序），对这些序列进行对齐和分析，得到碱基对齐图和聚类分析的结果。然后根据对齐图找出具有高度多态性的区段，在这一区段用Primers程序设计引物并在相应区段结合Oligo 5.0程序找出所有可能的探针，经过筛选后在Genebank中进行Blast查询，筛选出特异性最好的片段作为探针使用。 这种方法简单、快捷，充分利用了现有的基因资源。目前很多微生物检测探针［11,12］及植物cDNA探针［13］都是根据已公开的基因序列设计的。然而，对于大多数药用植物种类，其遗传背景很不清楚。已注册的药用植物DNA 序列的数量相对于总的药用植物资源非常有限，而且这些已知序列中大多集中在少数植物种类［14］，所以，这种方法只适合于遗传背景比较清楚或已有相关序列发布的药用植物。 2 通过构建的DNA文库筛选 这种方法要求先构建DNA克隆文库或cDNA文库，然后从文库中随机选出若干克隆，将各克隆插入片段斑点印迹在杂交膜上(如硝酸纤维膜、尼龙膜)，用标记的本种基因组和其他种基因组的总DNA 为探针分别进行斑点杂交，选择与本种基因组杂交时杂交信号强，而与其他基因组杂交时无杂交信号的克隆，该克隆的插入序列即为本种基因组的特异序列。 Q. Cai. M.R. Bullen［15］从梯牧草属(Phleum)两个野生种P. alpinum和P. bertolonii的DNA文库中分别筛选到它们的特异性探针。首先，提取P. alpinum 和P. bertolonii的总DNA，用Sau3AI部分酶切，然后将消化后片段用pUC19作为载体克隆到E. coli DH5amcr.构建了P. alpinum和P. bertolonii的部分基因组DNA文库（P. alpinum含3030 个colonies，P. bertolonii含3240 个colonies），接着从P. alpinum DNA文库中选了1230个克隆，从P. bertolonii DNA文库中选了1320个克隆斑点印迹在膜上，最后和通过缺口平移法采用［α～32P］-dCTP 标记的P. alpinum和P. bertolonii总基因组探针杂交，根据杂交信号挑选到P. alpinum特异性克隆8个，P. bertolonii特异性克隆13个，对其进行测序后筛选到3个P. alpinum特异性探针和3个P. bertolonii特异性探针。还有其它通过类似方法筛选到植物种特异性探针的例子［16,17］。 这种方法可以一次筛选大量克隆，能得到相当数量的探针，主要问题是构建DNA库过程比较繁琐