中药心复康在大鼠急性心肌梗塞后对移植骨髓间充质干细胞的保护作用论文.docVIP

　　中药心复康在大鼠急性心肌梗塞后对移植骨髓间充质干细胞的保护作用论文 李广斌，苏金玲，姜希娟，范英昌 【摘要】 目的探讨中药心复康在大鼠急性心肌梗塞后对移植骨髓间充质干细胞（BMSCs）的保护作用及其机制。方法经密度梯度离心联合贴壁筛选法培养并纯化BMSCs，采用冠状动脉结扎法建立大鼠急性心肌梗塞模型，移植前以5-溴脱氧尿核苷（Brdu）对移植细胞进行标记，术后采用中药心复康灌胃联合干细胞移植治疗。移植后2周ELISA法检测大鼠血清血管内皮生长因子（VEGF）含量；处死动物，免疫组织化学方法检测心肌损伤区VEGF蛋白表达情况、Brdu阳性移植细胞数和CD34+新生血管数。结果心复康联合干细胞移植治疗大鼠心肌梗塞.freeledicine XinFuKang(XFK) after rats acute myocardial infarction. MethodsBMSCs ethod. The rats yocardial infarction ethode easured serum VEGF by method of ELISA, the albumen VEGF, cell amount of Brdu(+) and neonatal vessels of CD34+ around the infarct area by method of IHC. ResultsThe method of XFK bining BMSCs transplantation increased livability of transplanted BMSCs and serum VEGF(pared en VEGF and neonatal vessels. Conclusionpared ply BMSCs transplantation, XFK hase better protection on the transplanted BMSCs. The mechanism maybe XFK can promote the vessels regeneration of infarct area. Key a公司)，CD44、CD34免疫组化试剂盒（天津联星试剂公司），BrdU石蜡切片免疫组化试剂盒（天津市灏阳生物制品有限公司），VEGF免疫试剂盒及ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），中药心复康（天津中医药大学第一附属医院制剂室）。 2 方法 2.1 BMSCs体外分离培养和BrdU标记本实验采用密度梯度离心和贴壁筛选法培养并纯化BMSCs，大鼠脱颈处死,.freell的Percoll预先置于试管的底部,然后按照1∶1的比例沿管壁缓慢滴加骨髓悬液,1 800 r/min离心20 min,收获位于界面层灰白色的单个核细胞,用L-DMEM离心洗涤2次,800 r/min离心5 min。以3.0×105/cm2的密度接种于L-DMEM完全培养液,置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中继续培养,48 h后首次换液,以后每隔3 d更换1次培养液,2周后细胞长满80%瓶底。 骨髓间充质干细胞的传代培养:将原代细胞瓶内的培养液弃去,D-Hanks液冲洗2次,以去除培养液中的血清,加入2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L乙二胺四乙酸消化细胞,显微镜下观察,控制消化时间。细胞收缩变圆时,立即加入含少量血清的培养液终止消化,用弯头吸管轻轻吹打细胞,收集细胞悬液,800 r/min离心5 min,弃上清。加入完全培养液充分吹打成单细胞悬液,按1∶3传代接种于75 cm2培养瓶内,待细胞铺满瓶底后依上法传代。 骨髓间充质干细胞的鉴定:选用生长状况良好的骨髓间充质干细胞,采用SABC法检测细胞表面抗原CD44+、CD34-的细胞即为所需细胞，实验发现第3代获得BMSCs的纯度超过95%［3，4］，实验用第3代细胞。 BrdU标记：每日观察原代及传代的细胞生长状况,需加BrdU的培养瓶中预先加入0.5 cm×1.0 cm无菌玻片,当细胞铺满瓶底50%时加入BrdU溶液10 μmol/L(BrdU 50 mg;二甲基亚砜0.8 ml;水1.2 ml)分别孵育24，48，72，96 h。取出玻片,用PBS冲洗,4%多聚甲醛固定15 min,进行Brdu免疫组化染色（严格按试剂盒说明进行）。 2.2 动物模型制备 同基因型雄性SCs移植移植前 48 h在培养液中加入终浓度为10 μmol/L 的 5-溴脱氧尿核苷（Brdu）对移植细胞进行标记。胰酶消化，PBS反复冲洗、离心（1 500 r/min，5 min ）2 次，加入 PBS 液调整细胞浓度为2×106/ml。治疗组手术结扎冠状动脉15 min后，再次