Marfey法与质谱联用技术_培训课件.ppt

以上结果也可如下证实，考察用FDPA、FDVA、FDIA、FDLA和D-FDAA的氨基酸衍生物的分离行为，如下表所示： 如所预期，随着烃基侧链增长，其保留时间也增长，判定能力也增强；而D-FDAA的氨基酸衍生物则显示了相反的洗脱顺序。 本机理有一缺陷，即明确地评价两个功能基团的疏水性是有困难的，可以考虑用氨基酸衍生物保留时间的顺序来解释洗脱顺序。因为在氨基酸中α－COOH是一个常见的功能基团，而一个氨基酸的FDAA衍生物的疏水性也决定于该氨基酸的侧链，因此，DL-氨基酸的tR和洗脱顺序间的关系已如Table1所示。 如Figure4所示，具有常规洗脱顺序（L D）的D-和L-氨基酸衍生物的tR要比侧链疏水性与α－COOH相当的氨基酸衍生物的长，例如丝氨酸和天冬氨酸。 另一方面，具有相反洗脱顺序的氨基酸衍生物具有相对较短的平均保留时间。 于是，目标氨基酸的洗脱顺序可以用L-和D-氨基酸衍生物的平均保留时间进行解释。DL-丝氨酸和天冬酰胺衍生物可被看作临界样品，它们的平均保留时间位于洗脱顺序的临界点上。 然而，鸟氨酸的二取代衍生物表现出非常有趣的分离行为，它们的洗脱顺序是相反的，尽管它们有相对较长的保留时间（27.3min），如Figure4所示。对这种分离行为的研究正在进行之中。 至此，第一个问题已基本得到解决。 由于氨基酸与L-FDAA所得衍生物的热不稳定性和低疏水性，致使它们对LC/MS分析的敏感性很差。于是，选择电喷雾离子化和frit-FAB作为接口，并发展用 (1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-亮氨酰胺，即L-FDLA取代FDAA: (1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺，作为衍生化试剂，以便将Marfey法和质谱联系起来。 Marfey法与质谱的联用 在Marfey法中，氨基酸的L-FDAA衍生物由常规的反相HPLC分离并在UV340nm处检测；在本法中，UV检测器被换成质谱仪，即氨基酸衍生物经LC/MS分析。 为了顺利地将传统的HPLC条件改为适合LC/MS分析的LC条件，必须解决如下两个问题： （1）将从HPLC洗脱出来的液体注入质谱仪时，其体积应大大减小，因为ESI和frit-FAB是最终被作为一种接口来使用的。 （2）HPLC流动相中的非挥发性缓冲液应用挥发性缓冲液代替。 解决方法： （1）应用半微量柱（150×2.1mm I.d,），本法用该柱给予L-和D-氨基酸衍生物以足够的分离度。若为frit-FAB LC/MS 溶液流速应进一步减小至5μl/min。 （2）使用TFA或醋酸铵缓冲液（PH＝3）作为流动相，与使用磷酸缓冲溶剂系统有几乎相同的分离度。 尝试了4种用于分析氨基酸L-FDAA衍生物的LC/MS接口，即ESI、大气压化学离子化（APCI）、TSP、和frit-FAB。极性氨基酸衍生物不能用TSP和APCI作为接口。 尽管任何氨基酸都可以用ESI和frit-FAB接口，但它们的灵敏度特别低，这可能是由于氨基酸的L-FDAA衍生物的热不稳定性和低疏水性造成的，表明需要制备一种高疏水性的衍生化试剂。此外， ESI和frit-FAB被选作接口，还因为使用这种接口可以抑制温度诱导效应。 在FAB-MS中，疏水性越强的化合物其分离效果越好。 衍生化过程 引入了一个外消旋化程序，使用DL-FDLA代替传统的化学外消旋化，以得到L-或D-氨基酸相应的对映异构体。 为了获得满足以下条件的衍生化试剂： （1）可获得更高疏水性的氨基酸衍生物； （2）不减少以前L-FDAA衍生物的特征UV吸收； （3）符合通常所言的分离机制。 ］ 尝试了4种衍生化试剂L-FDVA、L-FDPA、L-FDIA和L-FDLA，具体数据如Table1所示： （1）被测衍生化试剂的保留时间要比L-FDAA长； （2） L-FDLA ［M+H］+的离子丰度最高，约为L-FDAA的30倍。 由 Table2可知，L-FDLA的分离效果要强于L-FDAA 由Table1、Table2得，L- FDLA是用于LC/MS分析的最有效的衍生化试剂。 为了确证L-FDLA的实用性， L-FDLA的氨基酸衍生物使用以frit-FAB 或ESI作为接口的LC/MS进行分析。为了比较氨基酸的L-FDAA衍生物和L-FDLA衍生物在相同条件下的电离情况，两种衍生物的等量混合物进行LC/MS分析。如Ffigure1所示 DL-丙氨酸的L-FDAA和L-FDLA衍生物的［M+H］+阳离子质量色谱，其整体质谱使用frit-FAB 作为接口。L-FDLA衍生物的灵敏度比L-FDAA衍生物的提高了三倍，这种趋势适合于任何常见氨基酸。 对于ESI LC/MS，不管采用阳离子还是阴离子模式，灵敏度都提高2～4倍。 由上可知，