人体β防御素3突变基因的构建及在大肠埃希菌中的融合表达论文.docVIP

　　人体β防御素3突变基因的构建及在大肠埃希菌中的融合表达论文 【摘要】 目的 从人正常皮肤组织中提取β防御素3基因进行定点突变后在E.coli中融合表达。方法 从人正常皮肤组织中提取总RNA，经RTPCR扩增得到编码β防御素3成熟肽的cDNA序列，测序正确后，寻找合适的突变位点，设计含突变位点的引物，用PCR重叠延伸法对β防御素3成熟肽cDNA序列进行定点突变，将突变产物克隆至pUC18进行序列测定及在E.coli中融合表达。结果 测序结果表明，经RTPCR所得的β防御素3成熟肽序列与GeneBank中报道的编码人β防御素3成熟肽的cDNA序列完全一致。经过突变β防御素3成熟肽第29位谷氨酰胺密码子由CAG突变为精氨酸密码子CGA.freelutant gene of human betadefensin3 ABSTRACT Objective To extract the gene encoding human betadefensin3 (hBD3) from human foreskin tissue, make a sitedirected mutagensis and expression utant gene in E.coli. Methods The total RNA extracted from human foreskin tissue and the sequence of cDNA encoding hBD3 plified by RTPCR. After sequencing, a pair of mutant primers utation ade by overlap extension PCR and then the mutant gene utation, the code CAG for glutamine hBD3) gene is constructed and expressed in E.coli BL21 successfully. It might provide a foundation for construction of eukaryotic expression vector and research of its biological activity. KEY arker购自大连TaKaRa公司；pGEX4T1购自Pharmacia公司；PCR引物由上海生工公司合成。 1.2 方法 1.2.1 细胞总RNA的提取 临床获取正常人新鲜包皮组织约150mg，用总RNA提取试剂盒提取总RNA，操作按说明书进行。 1.2.2 RTPCR扩增人hBD3 cDNA 根据GenBank中编码hBD3成熟肽的45个氨基酸的cDNA序列设计一对引物，引物序列如下：上游引物(a)：5′GGGAATTCGGAATCATAAACAC3′，在引物5′端加上EcoRI酶切位点，并设计GG两个保护碱基；下游引物(b)5′GGGTCGACTTATTTCTTTCTTC3′在引物5′端加上SalI酶切位点，并设计GG两个保护碱基。以提取的总RNA为模板，a和b为引物进行RTPCR。RTPCR按试剂盒说明书进行，取10μl RTPCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察并记录结果。 1.2.3 hBD3基因的克隆及序列测定 将PCR扩增产物和pUC18用EcoRI和SalI双酶切，回收纯化后16℃连接过夜，转化于用常规CaCl2法制备的感受态E.coli DH5α中，经蓝白筛选挑取白色菌落，提取质粒，双酶切及针对pUC18多克隆位点设计如下引物进行PCR鉴定。上游引物：5′GCCAGGGTTTTCCCAGTC3′，下游引物：5′GCGGATAACAATTTCACA3′，并送上海生工测序。 1.2.4 hBD3基因的突变 根据hBD3的分子结构，找出合适的突变位点，设计一对突变引物，引物序列如下：突变上游引物(c)：5′GAGGAACGAATCGGCAAGTGCT3′，突变下游引物(d)：5′CGAGCACTTGCCGATTCGTTCC3′。应用PCR重叠延伸法［4］对hBD3基因进行定点突变(Fig.1)。①片段AD的获得：用引物a和d进行PCR反应，10×缓冲液5μl，MgCl2 3μl，dNTPs 4μl，引物a和d各1μl，模板1μl，无菌双蒸水34μl，Taq酶1μl，共50μl反应体系。94℃预变性5min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环，72℃延伸7min，取10μl扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察结果；