miRNA-21对产肠毒素性大肠杆菌黏附Hela细胞调控机制研究.pdf

摘 要 miR-21 是近年来发现的一种小 RNA 分子，在肿瘤发生及机体免疫调控中发挥着重要的作 用。miR-21 可通过调控 IL-12 、TLR4 和 NF-kB 等基因的表达，影响机体的免疫力，在抗微生 物感染中发挥重要作用。经 miRNA 在线靶目标预测软件分析发现，miR-21 靶基因中有许多黏 附相关因子，而肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli ，ETEC)通过产生的黏附素与细胞表面 受体结合，介导细菌黏附宿主细胞，是 ETEC 感染致病的前提条件。但有关 miR-21 对 ETEC 黏附宿主细胞的调控机制尚属未知。为研究 miR-21 对 ETEC 黏附 Hela 细胞的调控作用，本研 究应用脂质体将 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR-21 真核表达载体转染到 Hela 细胞中，并按 ETEC:Hela=100:1 的浓度作用不同时间，利用 MTT 法和 Giemsa 染色法检测 miR-21 对 ETEC 黏附 Hela 细胞的影响，同时利用实时荧光定量 PCR 方法检测不同作用时间 Hela 细胞 CCL20、 TGFBI、ITGB8 等黏附相关基因表达变化，以揭示 miRNA-21 对 ETEC 黏附 Hela 细胞的影响与 调控机制。主要研究结果如下： 1. 将重组miR-21 真核表达载体和阴性对照分别转染到Hela 细胞中，ETEC 与过表达miR-21 的 Hela 细胞相互作用不同时间后，MTT 法检测结果显示，过表达 miR-21 的 Hela 细胞黏附的 ETEC 数量比转染对照组黏附 ETEC 显著减少（P ＜0.05)，说明miR-21 能抑制 ETEC 黏附 Hela 细胞。 2.ETEC 黏附过表达 miR-21 的Hela 细胞后，经 Giemsa 染色后观察，可见大量紫色的杆状 细菌紧密黏附于 Hela 细胞表面，细胞中蓝色为细胞核。倒置显微镜下在每个试验组随机选取 100 个 Hela 细胞进行细菌计数。结果显示，过表达 miR-21 的Hela 细胞组黏附细菌数量要比阴 性对照黏附细菌数量显著减少（P ＜0.05)，进一步证实miR-21 能抑制 ETEC 黏附 Hela 细胞。 3.将重组 miR-21 真核表达载体和阴性对照分别转染到 Hela 细胞中，ETEC 与转染 miR-21 的 Hela 细胞相互作用不同时间后，实时荧光定量 PCR 检测结果显示，过表达 miR-21 的 Hela 细胞与转染阴性对照的 Hela 细胞相比，60min 后 CCL-20、TGFBI、ITBG8 mRNA 表达水平分 别下调 1.74 倍、2.11 倍、3.47 倍；90min 后分别下调 1.92 倍、2.35 倍、2.36 倍；120min 后分 别下调 2.33 倍、3.01 倍、2.49 倍；150min 后分别下调 2.77 倍、3.29 倍、2.74 倍；180min 后分 别下调 3.49 倍、3.92 倍、2.73 倍。表明 miR-21 能下调 CCL-20、TGFBI、ITBG8 基因水平的表 达。 上述结果表明，miR-21 可抑制 ETEC 黏附 Hela 细胞，并通过降低 Hela 细胞中 CCL-20、 ITBG8 、TGFBI 基因的表达水平，使 ETEC 感染 Hela 细胞下降，从而发挥抗 ETEC 感染的作用。 关键词：miR-21 ；产肠毒素性大肠杆菌；黏附因子；Hela 细胞 I Abstract miR-21 is a small RNA molecule which plays an important role in tumorigenesis and immune regulation. miR-21 can affect immunity by regulating expression of IL-12 、TLR4 and NF-kB,And plays an important role in anti-microbial infection. Bacterial adhesion host cell is a prerequisite f