一种新的人NK细胞系的特性及其抗肿瘤效应研究.pdf

摘要 摘要 自然杀伤细胞(Naturalkillercell，NK细胞)作为固有免疫系统的重要成 员在机体抗肿瘤免疫中扮演重要的角色。使用NK细胞进行抗肿瘤治疗已引起 人们高度的重视，目前已有研究进入了临床实验阶段。基于NK细胞的肿瘤免 疫治疗包括内源性NK细胞的诱导活化、同种反应性NK细胞输注、体外扩增 的自体或供者NK细胞及NK细胞系的过继转输等。相比较而言，自体或同种 异体NK细胞在进行抗瘤治疗时存在一定的局限性，而永生化的人NK细胞系 因具有较强的细胞毒作用、体外易扩增培养、且不存在其他细胞污染等优点， 可以克服自体或异体NK细胞的局限性，具有很好的临床应用前景。现有可用 于肿瘤治疗的NK细胞系(NK．92细胞)南西方国家建立，尽管mA分子不匹 配是NK细胞行驶功能的有益因素，但是由于不同种族间HLA分子的差异很可 能在受者体内产生抗HLA的抗体从而抑制免疫治疗的效果，故西方国家建立的 NK细胞系可能不适合用于中幽肿瘤病人的治疗。因此，建立国人的NK细胞 系并将其用于肿瘤治疗尤为重要。 另外，肿瘤的诊断及分期对于临床治疗方案的制定至关重要。肺癌作为恶 性肿瘤中最常见的死亡原因，严重威胁人类的健康。肺癌的高转移率和复发率 严重阻碍肺癌患者生存期的提高，寻找用于循环肿瘤细胞监测的标志物并建立 合适的检测方法成为亟需解决的问题。 本研究利川流式细胞术对本室己建立的人NK细胞系(NKG细胞)的表型、 活化状态及功能分子的表达进行分析；利用3H掺入实验测定不同剂量辐照后 NKG细胞的增殖情况；利用引Cr杀伤实验测定NKG细胞的细胞毒活性；建立 人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型评价NKG细胞的体内抗肿瘤活性；利用波浪式生物 反应器建立NKG细胞大规模培养的工艺流程，建立NKG细胞主细胞库和工作 细胞库，并按《药典》三部(2005年版)的相关要求进行了细胞鉴别试验、无 菌试验、外源性因子检测、致瘤性检查及急性毒性试验。另外，应用实时荧光 mRNA 定量PCR的方法检测LunX等多利，肿瘤标志物mRNA的水平，分析LunX 与肺癌病理分期及临床治疗效果之间的关系。利用上述方法所取得的研究结果 如下： 1．NKG细胞表型及功能分子的表达 NKG细胞是本研究室863课题组于2003年建立的永生化的人NK细胞株。 NKG细胞悬浮生长，成团细胞较多，倍增时间为2．3天。NKG细胞的表型鉴 摘要 1a、CD54、CDl NKG细胞表面表达高水平CD2、CD58、CDl1b及CDIlc等粘 附分子；高表达共刺激分子CD48。NKG细胞表面表达抑制性受体 granzyme 细胞具有活化性NK细胞的特征。 2．NKG细胞的抗肿瘤细胞毒活性及其分子机制 NKG细胞对多种肿瘤细胞系均有较强的杀伤活性，尤其是对SGC7901和 活性明显高于NK．92、NKL及YT细胞。体外抗体阻断及中和实验表明NKG 细胞的细胞毒活性主要依赖于NKG2D和NKp30识别机制。当Y辐照剂量达 800cGy时，辐照后的NKG细胞失去增殖能力，但在48小时内维持其对肿瘤细 胞的杀伤活性。体外实验进一步证明800cGy辐照后的NKG细胞对原代分离的 人卵巢癌细胞具有较强的杀伤活性(75％q5％，E／T=20／I)。 3．人卵巢癌小鼠模型中NKG细胞的免疫治疗作用 利用Ho．8910细胞以腹腔注射的方式接种裸鼠，成功建立人卵巢癌裸鼠腹水 瘤模型。当将800cGy辐照后的NKG细胞与Ho．8910细胞按5：l混合后接种裸鼠， 结果显示小鼠成瘤时间由28～44天延迟至90～135天，成瘤率由100％明显降低至 50％。NKG细胞治疗组小鼠腹围明显减少，尽管在观察时间内50％d,鼠死亡，但 其平均生存时间由61．5天明显延长至210．2天。以上结果表明NKG细胞在小鼠体 内对人卵巢癌细胞具有明显的杀伤功能。 当在Ho．8910细胞接种后第21天，给予800cGy辐照后的NKG细胞进行治疗， 结果表明治疗组小鼠成瘤时间由28-38天延后至56～66天，小鼠成瘤率由100％降 低至62．5％，成瘤鼠病情进展较缓慢，平均生存时间由64．6天延长至l19．6天。当