真核翻译起始因子3第4亚单位（eIF3g）在肿瘤细胞多药耐药中的作用.pdf

浙江大掌硕士研究生论文 为了从整体水平寻找新的肿瘤细胞耐药／胁R相关因素，我们课题组在前期 ADR)的培养液中，通过长时间递增剂量ADR的诱导，成功地获得了稳定的具有 MDR表型的多药耐药系K562／ADR，至今已六年余。该细胞系可常规培养于含有 性增加了约149倍；对长春新碱的耐受性增加了200倍以上。在此基础上，我们 运用了蛋白质双向电泳技术结合质谱分析，研究了K562／ADR细胞和K562细胞在 蛋白质表达上的差异。蛋白质双向电泳图谱表明，K562／ADR细胞与K562细胞相 比，既有一些蛋白质表达的明显的量上的差异，又有一些蛋白质从无到有或从有 到无的表达改变，这些蛋白质表达情况的变化，是人白血病细胞K562从对药物敏 感到接触到化疗药物ADR后产生多药耐药特性这一变化中细胞内一系列分子事 件的直接体现，是MDR表型产生的分子基础。我们对其中一个在K562细胞中无 表达、但在K562／ADR细胞中大量表达(考马斯亮蓝染色和银染)的蛋白质进行 了进一步的串联质谱(MS—MS)分析，鉴定为真核翻译起始因子3第4亚基 translationinitiationfactor3subunit (eukaryotic 4，eIF39)，根据国 际命名规则为eIF39， eIF一3是最大最复杂的真核翻译起始因子，包含至少12个亚单位，有a(p170， 蛋白亚单位的具体功能还未完全了解。 已有的研究表明，在人乳腺癌，子宫颈癌，胃癌，食道癌和肺癌中，elF-3 最大的一个亚单位elF3a／’p170／p150的表达显著提高，表达水平与临床病理类型 相关，并且其高表达可能是一个恶变早期的指标，并可能在癌细胞的生长、恶性 列腺癌和原发性乳腺癌中也呈现出高表达的情况。而elF3e／int6也被认为可作 为判断非小细胞肺癌中病人预后的一个指标。更重要的一个发现是，在对模式生 物酵母菌的研究中有迹象表明elF3的一个蛋白亚单位eIF3e／int6在真核细胞的 2 浙江大掌硕士研究生论文 耐药中发挥了作用。 本课题的研究对象是eIF3的另一个亚单位eIF39，目前人们除了对它在翻 译起始过程中的作用有少量的了解，尚未有文献报道其与包括肿瘤在内的任何人 类疾病相关。为了研究eIP39与肿瘤细胞多药耐药之间的关系，本课题克隆了 情况。具体内容如下： 1．eIF39全长编码区cDNA的克隆 为了获得eIF39cDNA，为进一步研究提供基本材料，本课题以K562细胞总RNA cDNA片段，克隆于pGEM-T 为模板，经R卜PcR，扩增得到969bp Easy载体，经DNA 编码区的cDNA。 GST融合蛋白的表达与兔抗血清的制备 2．eIF39 为了获得eIF39蛋白作为抗原来制备其抗体，本课题采用原核表达重组蛋白 cDNA切下，用Klenow酶将两端补平后插入 策略用EcoRI将上述克隆的elF39 pGEX一5卜2的SmaI位点，使该序列与载体上的GST基因开放阅读框保持一致，得到 约60kDa的GST—eIF39融合重组蛋白。该融合蛋白部分以可溶蛋白形式存在、部分 存在于菌体碎片沉淀(包涵体)中。用制备型SDS电泳后割胶、回收融合蛋 白，以回收的融合蛋白作为抗原制备兔抗eIF39。 3．eIF39 为了研究eIF39对肿瘤细胞MDR的作用，本课题构建了高效表达eIF39的哺乳 动物表达载体。首先用限制性内切酶屁。RI将eIF39cDNA从pGEM-T Easy-eIF39 表达载体，并转染Bcap37乳腺癌细胞，用Zeocin筛选转染的细胞，并用有限稀释 法进行单克隆化，用Western 浙江大掌硕士研究生论文 表明转染的外源(His)。一eIF39融合蛋白成功地获得了表达。 4．eIF39-EGFP融合蛋白表达载体的构建及亚细胞定位情况