细胞培养基本知识-培训课件.pptVIP

制备1000mlRPMI?1640培养基 RPMI?1640?干粉培养基10.4g（1包） 蒸馏水?400ml 　　　↓　 磁力搅拌至完全溶解? 　　　↓　 加三蒸馏水定容至1000ml 在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有0.22μm孔径滤膜的过滤器除菌，并分装成200ml/瓶，-20℃保存备用。 用前取一瓶溶解，每200ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。再加青霉素和链霉素至终浓度各为100U/ml。 ------- 细胞培养液 胰蛋白酶溶液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks 平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡 次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中， -20℃保存备用（以免分解失效），常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%） 胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右 胰蛋白酶溶液配制 D-Hanks’ 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS) KCl 0.40g KH2PO4 0.06g NaCl 8.00g NaCO3 0.35g Na2HPO4 0.048g D-Glucose 1.00g Phenol Red 0.01g 血清 热灭活：56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清 热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。 ?因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活后严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。 血清中的沉淀物 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌 EDTA·4Na 溶液 一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便 常用工作液浓度为0.02%。注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长 EDTA 溶液配制：用D-Hanks’ 平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4℃冰箱保存 消化液 分离组织和分散细胞 常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液 单独或混合使用 pH 调整液 NaHCO3 溶液 常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4℃保存 HEPES（分子量238.31）溶液 一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性 主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES 使用终浓度一般为10-50mmol/L 常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4℃保存。使用时可向100ml培养液中加入2ml HEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L 抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定 器材和液体的准备 细胞培养用的玻璃器材 培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，160℃，2小时干烤或15磅，121℃，20分钟蒸气灭菌后备用 手术器材、瓶塞、配制好的PBS液 15磅，121℃，20分钟蒸气灭菌 MEM培养液、小牛血清、消化液 用G6滤器负压抽滤后