八角莲愈伤组织中开环异落叶松脂素脱氢酶基因克隆、表达及功能鉴定.docVIP

八角莲愈伤组织中开环异落叶松脂素脱氢酶基因克隆、表达及功能鉴定 　　[摘要] 开环异落叶松脂素脱氢酶（secoisolariciresinol dehydrogenase，SDH）是鬼臼毒素（podophyllotoxin）生物合成途径中的关键酶。该研究通过基于SDH基因保守性序列的同源PCR方法，结合快速扩增cDNA末端（RACE）技术从八角莲Dysosma versipellis愈伤组织中克隆得到2个SDH候选基因SO282和SO1223，并实现了以上基因在大肠杆菌中的可溶性表达。体外酶活性分析表明重组SO282具有SDH活性，为后续研究八角莲中鬼臼毒素的生物合成奠定了基础 [关键词] 八角莲；开环异落叶松脂素脱氢酶；鬼臼毒素；生物合成 [Abstract] Secoisolariciresinol dehydrogenase （SDH） is a key enzyme involved in the biosynthetic pathway of podophyllotoxin.In this study，two SDH candidate genes，SO282 and SO1223，were cloned from callus of Dysosma versipellis by homology-based PCR and rapid amplification of cDNA end （RACE）.The SDH candidate genes were expressed in Escherichia coli and the subsequent enzyme assay in vitro showed that recombinant SO282 had the SDH activity. These results pave the way to the follow-up investigation of the biosynthetic of podophyllotoxin. [Key words] Dysosma versipellis；podophyllotoxin；SDH；biosynthesis doi：10.4268/cjcm 八角莲Dysosma versipellis是小檗科八角莲属多年生草本植物，其以根茎入药，主要用于治疗毒蛇咬伤、跌打肿痛、风湿性关节痛、淋巴结炎、乳腺癌、食道癌等疾病[1-2]。研究表明，八角莲根茎中主要含有鬼臼毒素（podophyllotoxin）、去氧鬼臼毒素（deoxypodophllotoxin）、山柰酚（kaempferol）以及槲皮素（quercetin）等多?N有效成分[3]，其中鬼臼毒素对于肿瘤以及细胞癌变具有显著的抑制作用[4]。然而，由于野生八角莲生长缓慢，分布区域局限且繁殖力低，加之过度采挖，八角莲野生资源已不能满足医药市场的需求[5-6]。另外，鬼臼毒素化学合成路线长、效率低，难以实现商业化。因此，解析鬼臼毒素的生物合成途径，有利于实现八角莲优质种源的筛选、株系的改良、栽培和培养条件的优化以及体内生物合成体系的调控，从而快速大量得到所需目的产物，更为重要的是获得的生物合成相关基因可在微生物中重新构建其生物合成途径，绿色、可持续、高效率生产鬼臼毒素，解决其药源不足的问题 开环异落叶松脂素脱氢酶是鬼臼毒素生物合成途径中的关键酶（图1），负责将开环异落叶松脂素（secoisolariciresinol）进行氧化脱氢生成重要中间体马台树脂醇（matairesinol）。研究表明，在桃儿七Sinopodophyllum hexandrum、美国金钟连翘Forsythia intermedia以及盾叶鬼臼Podophyllum peltatum中，均克隆得到开环异落叶松脂素脱氢酶（secoisolariciresinol dehydrogenase，SDH）相关基因[7-8]，而对于八角莲中SDH基因的研究还未见报道。本研究的目的在于克隆、表达并功能鉴定八角莲SDH基因，为后续研究八角莲中鬼臼毒素的生物合成奠定基础 1 材料 1.1 仪器与试剂 S1000 Thermal Cycer PCR仪（Bio-Rad，美国）；NanoDrop2000C微量分光光度计（Thermo Scientific，美国）；DYY-6C电泳仪（北京六一仪器厂）；DYCP-31DN电泳槽（北京六一仪器厂）；Biospectrum AV凝胶成像系统（UVP，美国）；Sigma 3K-15高速离心机（Sigma，德国）；电热恒温培养箱（上海一恒仪器厂）；培英HYG-A恒温摇床（太仓仪器厂，中国）；Cyberscan 510型