Bit1基因在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测论文.docVIP

　　Bit1基因在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测论文 滑玮，张伟，吕海鹏，辛晓燕 【关键词】 凋亡；Bit1基因；酵母菌双杂交；报告基因 Expression of Bit1 gene in a yeast t and reporter gene activation assay 【Abstract】 AIM: To construct a bait vector GAL4, and assay . METHODS: The Bit1 gene fragments plified by RTPCR from ovarian cell Caov3, and cloned into pUC19 for DNA sequencing. After verified by DNA sequencing, they GAL4, and the rebinant plasmids . RESULTS: The Bit1 gene fragments plified, and their expression product sho. CONCLUSION: Yeast t can be utilized to study Bit1interacting protein. 【Key; reporter genes 【摘要】 目的：用Bit1基因片段构建酵母双杂交诱饵载体，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法：运用RTPCR技术从卵巢癌细胞系Caov3中扩增出Bit1基因片段，克隆入pUC19质粒，经测序正确后，再克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中.freelega公司；PCR试剂盒，DNA重组所用的限制性内切酶购自Takara公司；T4 DNA连接酶购自Gibco公司；质粒提取试剂盒，DNA电泳胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司；酵母培养基购自Clontech公司. 1.2方法 1.2.1RTPCR扩增Bit1基因自行设计出克隆Bit1基因的引物.常规培养Caov3细胞，提取细胞总RNA, 加入下游引物和逆转录酶，45℃各作用30 min进行逆转录,反应条件为：70℃ 10 min, 42℃ 45 min, 95℃ 5 min. 再取逆转录产物加入引物P1和P2扩增Bit1基因.PCR反应条件为：94℃ 30 s, 61℃ 45 s，72℃ 50 s，共进行38个循环. 1.2.2RTPCR产物克隆及鉴定纯化的RTPCR产物经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，定向克隆入pUC19质粒，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选.酶切鉴定出含插入片段的阳性克隆，命名为pUC19－Bit1，然后进行序列分析. 1.2.3构建及鉴定诱饵载体用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切pUC19－Bit1和表达载体pGBKT7，回收Bit1基因及pGBKT7载体片段，载体片段与Bit1基因连接后转化大肠杆菌DH5α.经限制性内切酶分析,.freelL YPDA液体培养基中，振荡培养至A600=0.4～0.5.在室温下将培养液离心，弃上清，重悬沉淀，洗涤酵母细胞.再离心取沉淀，用1.5 mL 1×TE/LiAc溶液重悬，即为酵母感受态细胞. 1.2.5转化酵母感受态细胞将构建好的诱饵载体，鲱鱼精DNA和酵母感受态细胞，混匀后加入0.6 mL PEG/LiAc溶液.在30℃振荡培养, 加入DMSO后混匀, 在42℃水浴15 min, 冰浴2 min,离心, 去上清，以0.5 mL 1×TE重悬细胞后，铺于SD/Trp平板.于30℃培养36 h左右，直至带有诱饵载体的酵母克隆长出. 1.2.6HIS3和LacZ报告基因表达的检测用无菌牙签随机挑取酵母菌单个克隆，分别划线于有Trp，Ura，His，Leu营养缺陷的SD平板上，于30℃培养36 h，观察酵母菌的生长情况. 采用β半乳糖苷酶印膜法检测lacZ报告基因的表达.用无菌牙签随机挑取酵母单个克隆，点样于硝酸纤维素滤膜上.将带有酵母克隆的滤膜在液氮中迅速冷冻5 s后，置于室温裂菌.将点有菌体的滤膜面朝上，放在另一张同样大小浸有Z buffer/Xgal的_016077）比较分析表明，扩增得到的Bit1蛋白基因片段与原序列完全相符. 图1Bit1基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略） 图2重组质粒pUC19bit1 的EcoR I，BamHI双酶切鉴定（略） 2.3重组质粒pGBKT7－Bit1的酶切分析再分别用EcoRⅠ和BamHⅠ将Bit1基因片段从质粒pUC19－Bit1亚克隆入pGBKT7载体，重组质粒pGBKT7－Bit1的酶切鉴定结果(图3). 2.4HIS3报告基因表达的检测将含有单纯AH109和含有pGBKT7Bit1质粒的酵