HDAC6表达载体转染对胃癌细胞株SGC7901生物学行为的影响论文.docVIP

　　HDAC6表达载体转染对胃癌细胞株SGC7901生物学行为的影响论文 【摘要】 目的： 观察组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）过表达对胃癌细胞SGC7901的增殖以及对化疗药敏感性的影响. 方法： 免疫细胞化学法筛选HDAC6表达阳性或表达相对高的胃癌细胞株；HDAC6真核表达载体转染胃癌细胞；TT法和克隆形成试验检测转染细胞的增殖情况；流式细胞仪检测转染细胞对常规化疗药诱导凋亡的敏感性. 结果： 胃癌细胞株HDAC6表达水平SGC7901细胞（0.28±0.07）明显高于BGC823细胞（ 0.19±0.04），差异具有统计学意义（P＜0.05）；转染细胞HDAC6蛋白表达水平明显高于空载体转染组及非转染组（3592±238 vs 1900±133，1686±177,P＜0.05）；细胞增殖能力转染组明显高于非转染组和空载体转染组（P＜0.05）；转染组细胞凋亡率明显低于空载体转染组和非转染组［（10.46±0.65）% vs（20.59±0.88）%,（22.31±1.40）%，P＜0.05］. 结论： HDAC6在胃癌细胞中呈阳性表达，可增强胃癌细胞SGC7901的增殖能力，降低胃癌细胞对化疗药物的敏感性. HDAC6可能是胃癌治疗的潜在靶点. 【关键词】 HDAC6基因；胃肿瘤；转染；细胞增殖；凋亡 0引言 肿瘤的发病机制十分复杂，近十余年来，组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases.freela公司）；兔抗人HDAC6多克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；SP免疫组化试剂盒（北京中杉金桥公司）；G418（德国Merk公司）；阳离子脂质体LipofectamineTM 2000（美国Invitrogen公司）；顺铂(cisdiamminedichloroplatinum，CDDP)（山东齐鲁制药厂）；HDAC6表达载体pCDNA3.1HDAC6FLAG（美国匹兹堡大学艾军魁博士构建并惠赠，pCDNA3.1质粒具有新霉素抗性基因）. 1.2方法 1.2.1细胞培养将胃癌细胞株SGC7901，BGC823分别培养于RPMI1640（含100 mL/L小牛血清、10万U/L青霉素、10万 U/L链霉素）细胞培养液中，置于37℃ 50 mL/L CO2培养箱中常规培养. 取对数生长期的细胞用于实验. 1.2.2免疫细胞化学取1 cm2盖玻片放入6孔板中，将对数生长期的胃癌细胞SGC7901，BGC823分别制成1×108/L单细胞悬液，每孔1 mL加入6孔板中，分别接种12孔，常规培养，细胞融合度达50%～60%时，小心移出玻片，PBS漂洗，750 mL/L乙醇固定. 按常规免疫细胞化学法分别检测HDAC6基因在两种细胞中的表达水平. 染色结果用计算机图像分析系统处理，自动记录吸光度A值，每张切片取5个视野,取A均值. 选取HDAC6表达水平相对高的细胞株作为进一步的实验对象. 1.2.3G418筛选浓度的确定密度为1×106/L的单细胞悬液按每孔1 mL接种于24 孔板,G418按0，100～1100 mg/L 的终浓度依次加入各孔中, 观察细胞的生长状况, 以第10日细胞全部死亡的最低浓度为G418的筛选浓度. 1.2.4细胞转染实验分为HDAC6表达载体pCDNA3.1HDAC6FLAG转染组（转染组），空载体pCDNA3.1转染组（空载体转染组）及非转染组3组. 转染前按4×105个细胞/孔，在6孔板中接种对数生长期的胃癌细胞SGC7901，常规培养过夜. 细胞融合度达60%～80%时，更换无血清、无双抗RPMI 1640培养液,按LipofectamineTM 2000试剂盒说明书进行转染. 6 h后除去转染试剂，更换成常规培养液继续培养过夜. 转染后24 h，将细胞以1∶10的的比例传代至含G418（浓度为600 mg/L）的选择性培养液中继续培养，每周用该选择性培养液换液1次，8 in离心10 min, PBS洗2次. 裂解细胞, 以Bradford法测定细胞蛋白浓度. 将样品的蛋白浓度调整一致, 各取20 μL上样行SDSPAGE, 电泳后转至NC膜上, 含10 g/L脱脂奶粉的TPBS室温封闭2 h,.freelin，使紫兰色沉淀完全溶解，用酶标仪于490 nm波长处测每孔的A值. 以时间为横坐标，每组平均A值为纵坐标，绘制细胞生长曲线. 1.2.7平板克隆形成试验生长旺盛的各组胃癌细胞分别接种于直径为60 mm的培养皿，每组设3个平行皿，每皿依次含50，100，200个细胞，常规培养2 L/L乙醇固定，姬姆萨应用液染色. 将干燥后的培养皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，肉眼直接计数克隆