RT┐PCR分析肉芽组织生长过程中VEGF及β3整合素mRNA的表达论文.docVIP

　　RT┐PCR分析肉芽组织生长过程中VEGF及β3整合素mRNA的表达论文 .freelRNA在肉芽组织血管生成中表达的动态变化. 方法 采用RT-PCR法定量分析人正常皮下组织、增殖期肉芽组织（伤后7～12d）及成熟期肉芽组织（伤后30～35d）VEGF及β3整合素mRNA的水平. 结果 在正常皮下组织中，VEGF及β3整合素mRNA呈低表达，而在增殖期肉芽组织中表达升高，待肉芽组织完全成熟后二者的表达又有所降低. 结论 VEGF及β3整合素mRNA的水平与肉芽组织的血管生长过程呈动态相关，提示两种蛋白质可能在肉芽组织血管生成中发挥调节作用. Keyic changes in the ex-pression of vascular endothelial groRNA during the angiogeic process of granula-tion tissue.METHODS VEGF and integrinβ3mRNA inhuman normal subcutaneous tissue.freelature granulation tis-sue（30～35days post-injured）al subcutaneous tissue，VEGF and integrinβ3mRNA ature pletely，the expres-sion of VEGF and integrinβ3declined again.CONCLUSION The levels of VEGF and integrinβ3mRNA are related to the groay play an important role in regulat-ing the angiogeic process of granulation tissue. 0 引言 血管生成指在已有血管床基础上长出新的毛细血管的过程，包括血管内皮细胞的激活，细胞外基质的降解，内皮细胞的增殖、移行，管腔结构形成及血管外膜的形成，然而迄今为止确切的机制尚不清楚.已有研究表明，许多病理过程如肿瘤的生长及转移、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎等，都与血管生成密切相关［1］ .生理状态下，血管生成仅存在于胚胎发育、创伤愈合及女性生殖周期中，与病理性血管生成不同，这些过程中血管的生长受到严格调控，包括了增殖、成熟、退化三个阶段，反映了血管生成的全过程.然而，对这些过程中血管生成的研究却很少.生长因子和粘附分子作为血管生成的重要调节分子，越来越受到人们的重视，其中血管内皮生长因子（vas-cular endothelial groRNA的表达，揭示它们与生理性血管生成的关系. 1 材料和方法 1.1 材料 肉芽组织标本均取自我院门诊换药室患者，4例为皮肤撕脱伤，1例为狗咬伤，患者年龄20～30岁，排除糖尿病等影响伤口愈合的疾患，分别于伤后7～12d和30～35d取创面组织.正常皮下组织取自我院手术患者. 1.2 试剂及仪器 异硫氰酸胍、Sarcosyl，AMV逆转录酶、Taq酶、dNTP，RNAsin分别购自原平生物公司和Promga公司;DNA THERMAL CYCLER480，美国PE公司;GDS凝胶成像系统，美国UVP公司. 1.3 RT┐PCR 1.3.1 引物设计 按文献报道［2，3］，VEGF上游引物序列:5’-GCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3’，下游引物序列:5’-GTGCTGACGC-TAACTGACC-3’，PCR产物为567bp，495bp和363bp，β3整合素上游引物序列:5’-GTGCT-GACGCTAACTGACC-3’，下游引物序列:5’-CATGGTAGTGGAGGCAGAGT-3’，PCR产物为285bp. 1.3.2 总RNA提取及定量 所取组织用Chom-czynski改良一步法提取总RNA，通过测定A260 值计算RNA浓度，A260 /A280 判定纯度. 1.3.3 RT-PCR反应 各组织总RNA均取1μg（10μL），加25μmol L-1 逆转录引物（下游引物）1μL，70℃10min后立刻冰浴，加入下列成分:DV1μL（5U），42℃逆转录1h，94℃5min，冰浴5min.各取RT产物10μL，进行PCR扩增，反应条件同于常规PCR，循环温度为:94℃1min，55℃1min，72℃2min，循环数分别采用15，20，25和30，根据结果选择合适循环数，避免PCR反应平台期，最终确定为25个循环，0.2g L-1 琼脂糖凝胶观察结果. 1.3.4 荧光分析 琼脂糖凝胶电泳结束后，在UVP凝胶成像系统上摄像，并用相