Smad蛋白在BMP2诱导成骨分化过程中的作用论文.docVIP

　　Smad蛋白在BMP2诱导成骨分化过程中的作用论文 【摘要】 目的 研究Smad蛋白在骨形态发生蛋白2(BMP2)诱导成骨分化过程中作用，探讨Smad蛋白在成骨分化期间信号传导的机制。方法 将取自MDX大鼠颅盖骨组织分离获得成骨细胞进行培养，培养的成骨细胞分组，加入不同浓度的BMP2或BMP2与Trx2SARA混合物后，用反义PCR和P2或BMP2和Trx2SARA，取不同时间点处死动物，制备组织切片，用SO染色进行组织学观察。结果 BMP2处理的成骨细胞碱性磷酸酶增加.freelRNA增加，Smad蛋白的表达水平呈剂量依赖性增加。Trx2SARA处理组出现碱性磷酸酶和降钙素mRNA下调。体内实验组织切片SO染色显示，BMP2处理组大部分异位组织由增殖中、肥厚前和肥厚软骨细胞构成，而Trx2SARA处理组很少向软骨源细胞分化。结论 Smad蛋白在BMP2诱导成骨分化中发挥重要的信号传导作用。 【关键词】 Smad蛋白质类 骨形态发生蛋白质类 成骨分化 ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of Smad protein on osteogenesis induced by bone morphogeic protein2 (BMP2) signal.MethodsPrimary calvarial osteoblasts ent. Reverse transcription PCR (RTPCR) and P2 signaling. ［KEY P2)是转化生长因子β（TGFβ）家族成员之一，可促进多种细胞的生长、分化和抑制细胞的凋亡。在生长发育过程中，BMP2是调节成骨的重要生长因子。然而，关于BMP2在诱导成骨分化方面的作用机制目前尚不清楚。为此，本研究旨在分析Smad蛋白在BMP2诱导新骨形成过程中的作用，探讨Smad蛋白在BMP2诱导成骨分化过程中的作用机制。 1 材料和方法 1.1 实验动物 选择雄性MDX小鼠12只， 2～3周龄，体质量27～35 g。 1.2 细胞培养 取MDX小鼠的颅盖骨，通过一系列酶消化方法分离获得成骨细胞1，进行细胞培养，在培养板上细胞达到80%的融合后分组，各组分别加入500、200、0 mg/L的BMP2 作用24 h，收获细胞进行蛋白和RNA分析。为观察BMP2诱导长期的成骨细胞分化，将培养的成骨细胞又分为3组：1组加入浓度为500 mg/L的BMP2，2组加入BMP2和Trx2SARA，3组不加入任何物质做为对照。5 d后对细胞进行蛋白和RNA分析。 1.3 反义PCR(RTPCR)和P2注射组（Ⅰ组）和BMP2与Trx2SARA注射组（Ⅱ组）。Ⅰ组和Ⅱ组于海绵内装填50 μg的BMP2，海绵冻干放入肌袋内，用50可吸收线间断缝合肌肉和皮肤组织。在BMP2植入前2 d，Ⅱ组动物注射10 μg/L的Trx2SARA。苏醒后笼内放养，正常进食、饮水。在手术后2周处死动物。标本用40 g/L的多聚甲醛固定3 d，4 ℃下在200 g/L EDTA(pH 7.4)中脱钙5 d。脱钙后，标本用梯度乙醇脱水，石蜡包埋，10 μm厚切片，置于TESPA处理的载玻片上。切片脱蜡，通过梯度乙醇浸入水中重新水化，随后进行SO染色行组织学观察。 2 结 果 应用不同剂量的BMP2处理24 h，BMP2处理的成骨细胞主要向成骨细胞分化，表现为碱性磷酸酶（ALP）和降钙素mRNA增加，以及成骨细胞分化的基因表达增加(图1)。P2和Trx2SARA处理的成骨细胞，ALP和降钙素mRNA水平下降（图3、4）。 组织切片SO染色显示，术后2周BMP2处理组大部分异位组织由增殖中、肥厚前和肥厚软骨细胞的软骨构成(图5)。Trx2SARA处理组很少向软骨源性分化，很少观察到肥厚软骨细胞(图6)。 3 讨 论 骨形态发生蛋白是从骨基质分离提纯的一类能高效诱导骨、软骨组织发生的酸性糖蛋白，是一组结构相关性的多功能细胞因子,具有广泛的生物学活性，如参与早期胚胎发生的身体构建，控制软骨、骨和性器官的形成，促进组织修复，调节细胞的增殖、凋亡、分化和迁移，调节免疫和内分泌功能等。到目前为止,共发现了30多种的骨形态发生蛋白3。BMP可分为几个亚族，BMP2和BMP4结构高度相 似，BMP5、BMP6、BMP7和BMP8在结构上相似，BMP2、BMP4、BMP6和BMP7在体内可诱导骨和软骨形成4。 Smad蛋白家族是近年发现的新的细胞内信号传导蛋白，直接参与骨形态发生蛋白等多个成员的信号转导5～7。在胚胎发生、个体形成、非对称器官的形成过程中具有重要作用。在