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　　P物质对体外培养成骨细胞增殖和活性的影响论文 【关键词】 骨细胞 Effect of substance P on proliferation and activity of osteoblasts in vitro 【Abstract】 AIM: To observe the effect of substance P (SP) on the proliferation and activity of osteoblasts cultured in vitro. METHODS: The calvarium bone of neining the ALP activity and observing the changes of cell cycle. RESULTS: SP of 1×10-12-1×10-6 mol/L had enhancing effects on the proliferation and activity of osteoblasts, ol/L had the strongest enhancing effects. CONCLUSION: SP has enhancing effects on the proliferation and activity of osteoblasts. 【Keyol/L的SP对成骨细胞的增殖和活性都有促进作用，在浓度为1×10-8 mol/L对成骨细胞增殖和活性的促进作用最强. 结论: SP对成骨细胞增殖和活性有促进作用. 【关键词】 P物质；成骨细胞；增殖；活性 0引言 P物质（substance P，SP）是最早发现的神经肽，已经证实SP神经肽免疫阳性神经纤维的变化贯穿于正畸牙周组织的破坏吸收以及再生修复的整个过程. 并且主要是SP.freela公司），碱性磷酸酶试剂盒（北京中生北控生物科技股份有限公司），Triton X100（华美公司），SP（Sigma公司），DNAprep Regain Kit（BeckmanCoulter公司）；酶联免疫检测仪（华东电子管厂），ELITE ESP型流式细胞仪（BeckmanCoulter公司）. 1.2方法 1.2.1成骨细胞的培养取出生24 h内的SD大鼠（购于第四军医大学实验动物中心）为实验对象，采用颅盖骨消化法培养成骨细胞. 待细胞长满培养瓶壁时传代培养，传至第2代时用差速贴壁法除去成纤维细胞. 1.2.2成骨细胞增殖检测―细胞计数法将第3代的成骨细胞用胰蛋白酶消化，用含100 mL/L血清的DMEM培养基稀释成5×107/L的细胞悬液，以每孔1 mL接种于24孔培养板. 培养24 h，然后更换为含有不同浓度SP的培养基继续培养［终浓度为0（对照），1×10-12，1×10-10，1×10-8，1×10-6 mol/L］，每浓度6个平行孔，48 h后消化，计数. 1.2.3成骨细胞增殖检测―MTT法将第4代的成骨细胞消化，并稀释成5×107/L的细胞悬液，以每孔200 μL接种于96孔培养板. 培养24 h，然后更换为含有不同浓度的SP培养基继续培养，每浓度6个平行孔,常规MTT法测量，使用酶联免疫检测仪测量A490 nm值. 1.2.4成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性检测细胞处理方法同MTT法，用不同浓度的SP培养基培养,每浓度6个平行孔,常规ALP活性检测法检测，通过酶联免疫仪测量A410 nm值. 1.2.5成骨细胞的细胞周期检测将第3代的成骨细胞消化后稀释，每50 mL培养瓶接种5 mL细胞悬液. 培养24 h，然后更换为含有不同浓度SP的培养基继续培养48 h，再次消化，洗涤，固定，4℃过夜. 调整细胞数在1×109/L，各样本加入DNAprep stain染液500 μL，避光染色30 min，用ELITE ESP型流式细胞仪测定DNA含量，并用Multicycle软件分析细胞周期分布情况. 统计学处理：数据以x±s表示，使用SPSS 10．0 for TT计数及ALP活性结果影响最大，其A值与对照组有显著差异(P 0.01, 表1). 当SP在1×10-8 mol/L时，对细胞周期影响最大，S+G2M期细胞数量最多(表2).表1成骨细胞细胞计数、MTT、碱性磷酸酶活性测定(略)表2成骨细胞的细胞周期测定（略） 3讨论 在人体多种骨组织内分布有SP样神经纤维，包括长骨，关节，牙齿等. 以往的研究证实SP与骨代谢联系密切. 在骨折愈合过程中，发现SP样神经纤维与毛细血管一同出现在新生骨组织的周围；Sandhu等［1］观察到切断交感神经可促进外周SP的释放增加和骨的吸收. 其原因可能为切断交感神经后使得交感神经对所支配骨组织内的神经生长因子的摄入减少，而感觉神经