Stat3靶向RNA干扰重组体的构建及鉴定论文.docVIP

　　Stat3靶向RNA干扰重组体的构建及鉴定论文 吕伟 张超 郝迎学 刘伟 余佩武 【摘要】 目的 设计针对Stat3的发夹样RNA干扰重组体，通过脂质体转染结肠癌细胞HCT116观察其干扰效果，为探索肿瘤基因治疗的新途径奠定基础。方法 设计针对Stat3编码区的有短发夹结构的两条DNA序列，经退火成互补双链，克隆到载体Pavu6＋27中构建重组体Pavu6＋27Stat3，再对重组质粒进行酶切鉴定、DNA测序分析。脂质体法转染重组体至大肠癌HCT116细胞株中，以空质粒(Pavu6＋27)转染为对照；RTPCR法观察Stat3基因表达改变。结果 酶切鉴定和测序分析均提示Stat3靶向RNA干扰重组体的构建成功，Pavu6＋27Stat3转染后HCT116细胞Stat3基因表达较空载体Pavu6＋27转染的对照组显著下降。结论 Stat3靶向RNA干扰重组体成功构建rnaidesigner/oligoDesigner)设计针对Stat3特异的siRNA序列(19nt)：TGCATAGGACGGAATGAAC，以BLAST分析所设计序列的特异性。构建siRNA表达载体的模板序列为：5TCGACTGCATAGGACGGAATGAACAAGCGTTCATTCCGTCCTATGCATTTTTT3；5CTAGAAAAAATGCATAGGACGGAATGAACGCTTGTTCATTCCGTCCTATGCAG3。寡核苷酸链由上海生物工程技术公司合成，核苷酸链在退火缓冲液中退火后, 与SalⅠ，XbaⅠ双酶切的线性化Pavu6＋27载体连接，连接产物转化感受态细菌JM109，挑选单菌落，筛选重组体，重组体命名为：Pavu6＋27Stat3(图1)。重组体质粒用Hind Ⅲ和BamHⅠ限制性内切核酸酶进行双酶切，阳性克隆送上海生工生物公司检测核苷酸序列。 图1 构建重组表达载体技术路线图 1.2.2 细胞培养及转染 细胞培养于含10%灭活小牛血清、1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM高糖培养液中，于37 ℃、体积分数为5% CO2的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。采用Roche公司的DOTAP脂质体转染试剂盒包裹经灭菌处理的重组质粒(质粒∶脂质体=1∶6)。转染前1 d，换取新鲜培养液(含10%小牛血清的DMEM高糖培养液，37 ℃，体积分数为5% CO2孵箱中培养)后调整浓度为2×105/ml，以每孔2 ml接种于6孔培养板中培养，待细胞增至60%～80%时，将质粒脂质体复合物转染至细胞中，18 h后弃去转染液，换新鲜培养液继续培养，弃去原培养液，用含G418 300 μg/ml的DMEM培养液进行筛选收集G418抗性细胞。转染了Pavu6＋27Stat3 siRNA的HCT116细胞简写成Pavu6＋27Stat3 siRNA HCT116细胞。转染空质粒的Pavu6＋27的HCT116细胞简写成Pavu6＋27 HCT116作为对照。 1.2.3 半定量RTPCR法检测Stat3 mRNA表达［7］ Pavu6＋27Stat3 siRNA HCT116细胞中Stat3mRNA表达改变，以Pavu6＋27 HCT116为对照。收集培养的2种细胞分为4组,按Tripure操作说明，分别提取总RNA，紫外分光光度计定量，调整浓度为1 g/L。取2 μl Total RNA 与1 μl Oligo (dT) 70 ℃ 5 min，置于冰浴5 min，加2 μl 10 mmol/L dNTP混合，5 μl 5×Buffer，1 μl MMLV反转录酶，1 μl RNAsin，去离子水补至25 μl。42 ℃ 60 min，-20 ℃冻存。PCR反应体系为：2 μl反转录产物(模板)，两对引物各1 μl(选用看家基因甘油醛3磷酸脱氢酶GAPDH基因作为内参照，GAPDH上游引物的序列为5AATTCAACGGCACAGTCAAGGC3，下游引物的序列为5GGATGCAGGGATGATGTTCTGG3，扩增片段为467 bp。Stat3上游引物序列为5GTCAGATGCCAAATGC3，下游引物的序列为5CCTGGAGGCTTAGTGC3，扩增片断长度386 bp，引物序列设计合成均由大连Takara公司完成)。2.5 μl 10×Buffer，2 μl 25 mmol/L MgCl2，2 μl 10 mmol/L dNTP混合，0.5 μl Taq酶，去离子水补至25 μl。反应条件为：预变性94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min共30个循环；72 ℃延伸10 min。取10 μl产物2%琼脂糖凝胶电泳，对照分子量