徐长卿诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的实验研究.pdfVIP

2．4．1 DNA梯度电泳(DNALadder)观察DNA降解片段： DNA提取：药物组和正常细胞组的细胞在培养48hr后，常规抽提DNA。 Ladder． 检测方法：运用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 结果判断：正常活细胞DNA显基因组条带位于加样孔附近，坏死细胞由于其DNA 的不规则降解显一条连续的膜状条带，凋亡细胞的DNA则因为DNA降解为180bp或其多 聚体组成的寡核苷酸片段显“梯状(1adder)”条带。 2．4．2流式细胞术观察徐长卿提取物对HepG-2肝癌细胞凋亡的影响： HepG一2细胞的培养及处理：取对数生长期的细胞，0．06％胰酶消化后制成单细胞 悬液0．4％台盼蓝染色，计算活细胞率为97．5％。将细胞悬液接种至50cm2培养瓶中，10e 个细胞／瓶，在37℃，5％C0。、饱和湿度条件下培养24／J时后，加入含药培养基。药物 组：每瓶培养液5ml中加入徐长卿水提物终浓度为229／L、119／L；对照组加入等量2％ DMEM。加药后于24d时、484,时每个时间点各取3瓶细胞，进行检测。 凋亡细胞的检测：小心弃掉培养液，0．06％胰酶消化3分钟，轻轻吹打细胞成单细 x Buffer重悬细胞至1 胞悬液，1000r／min离一L,IO分钟，Binding lO／ml，取lOOul细胞 ulAnnexinV-FITC，10lI1 悬液至5mlFACS管中，加入5 F混匀，室温下避光孵育15 分钟后每管加入400ul 管(主细胞)和补偿设置管，即未染色的细胞，单染AnnexinV-FIT的管和单染PI的管 o 的细胞群体，对细胞群体进行设门(Gate)，再以门中细胞进行后续荧光信号检测。将 对照管(裸细胞)的荧光强度设定为非特异性本底荧光，并在此基础上确定阳性荧光表 达比率．调定流式细胞仪，使荧光散入图中裸细胞集中分布在左下象限。保持FLl、 能软件进行分析。 3．结果 3．1徐长卿对HepG一2细胞增殖的影响： 徐长卿水提物在毒性试验中测定所得，对HepG--2细胞的药物半数毒性浓度TC。为 果如表3显示。徐长卿水提物及醇提物在浓度509／L，细胞出现空泡、萎缩、脱落，破 可见细胞形态大致正常。 3．2徐长卿对HepG-2细胞生长曲线的影响： H 、42．4万／m1。徐长卿水提物浓度为229／L和浓度为1lg／L，与对照组细胞相比，明显 低于正常组，说明徐长卿水提物具有抑制肝癌细胞增殖作用。而徐长卿醇提物在浓度 为1lg／L和浓度为5．59／L，其细胞数与对照组细胞相比，差异不大。说明徐长卿醇提 物对Hep—G2细胞没有显著抑制作用。 3．3徐长卿对HepG-2肝癌细胞周期的影响： 徐长卿水提物高剂量作用48小时后，HepG一2细胞的细胞周期发生明显变化， 的细胞占细胞总数的9．68％，与对照组相比明显降低，对照组为15．1％．细胞周期分析 显示，说明徐长卿水提液使该细胞生长阻止于GO／G1期。而徐长卿低剂量组则与对照 组相比，无显著性差异，但仍可见与大剂量相若的作用趋势。 3．4徐长卿提取物对HepG-2肝癌细胞凋亡的影响： 直方图上，G1峰前出现的亚二倍体峰(Sub-G。峰)即凋亡细胞所形成的凋亡峰(仰峰)， 差异显著。 4．结论 4．1徐长卿水提物及醇提物对体外培养的人肝癌细胞HepG一2生长有抑制作用，且水提 物较醇提物毒性小。 4．2徐长卿水提物能抑制HepG一2细胞的生长，而徐长卿醇提物对细胞增殖没有明显的 抑制作用。 4．3徐长卿水提物抑制体外培养肝癌细胞的S期，使细胞进入G2一M期受阻； 4．4徐长卿水提物具有诱导人肝癌细胞系HepG-2细胞凋亡的作用。 关键词徐长卿；肝细胞癌；细胞凋亡 Ⅲ Abstract 2．Objective Tosearchaneffectiveof detectthe