产肠毒素大肠杆菌ETEC987P菌毛fasG亚单位的克隆和表达.pdfVIP

亚单位的克隆和表达 罗何峰’王劫 苟钟勇 彭健” (华中农业大学动物营养与饲料科学系，武汉430070) 摘要利用PcR技术从987P标准茵棰板中扩增不舍信号肤的缸G基因片段。将其克隆到表达栽体 基因工程茵。经过I兀℃诱导表达．诱导表达产精(40KD)表达量占到了垒茵体蛋白的8％，经过超声波破碎分 析，表达产物主要存在于不溶挂的包涵体中，包涵体中表达产物的纯度达到50％。w髓t蜘lbh虹嚷分析表明，诱 导表达产物即为目的蛋白。但是在本试验中没有能实现目的基因的高效表选，初步估计可能是由于存在mRNA的 二级结构和目的基因鳊码区稀有密码子舍量较高所造成的，在之后的试验中可班考虐采用更换栽体和对目的基因 序列进行优化等方案来提高表达量。 987P 关键词ETEc kc克隆表迭 肠毒素大肠杆菌(￡，啦m加峨妒nicc西曲8枞缸mEE7IEc)是引起哺乳仔猪和断奶仔猪腹泻的主要 病原菌之一【I。J。眦c的致病机理是：首先借助自身特异性菌毛黏附于宿主小肠黏膜的上皮细胞， 对抗肠道的蠕动和消化液的冲刷而不被排出体外，继而在小肠上大量繁殖并释放肠毒素，肠毒素刺激 小肠上皮细胞分泌大量的体液进入肠腔导致腹泻”1。ErEc特异性菌毛的黏附作用是ETEc致病的先 决条件，若能有效抑制阿c在小肠上的黏附，则可以预防仔猪腹泻的发生。在引起仔猪腹泻的 987P阳性菌是引起新生仔猪腹泻的主要肠毒素大肠杆菌之一【6“J。987P菌毛是一种特异蛋白质， 具有非常好的抗原性。利用菌毛抗原免疫母体为仔猪提供被动保护，或者用高免的菌毛抗体制剂直接 对仔猪进行免疫保护，能有效抑制987P阳性菌在小肠上的黏附，都是预防酗匝c987P感染致病的有 效途径”。。然而，987P阳性菌在体外培养易受到环境影响，常常出现非菌毛化现象，从而增加了 987P菌毛抗原的提取和纯化的难度，这也进一步增加了疫苗和抗体制备的难度”o。利用基因工程技 术稳定表达987P茵毛抗原蛋白。为解决这一问题提供了思路。 987P菌毛的编码基因定位于质粒上，其基因簇由fasA一缸H8个基因组成，它们分别表达8种分 是菌毛合成所必需的亚单位，还是产生黏附作用的主要蛋白。因此，‰G基因是987P的核心 基因㈨1”。 本试验拟克隆表达987P菌毛黏附素基因f*G，实现其在大肠杆菌中的高效表达，为制备ETEc 的基因工程疫苗、特异性卵黄抗体提供新的途径。 ·基金项目：新世纪优秀人才支持计划(NcEP一04一0732)．裸圳市科技计划项目(新型饲料添加剂的产品研发及其高效饲养 瘦离型猪的配套技术研究)。 作者简介：罗何峰(1984一)。男．硕士，主要从事分子营养研究。E—m正l：出血e国126com。 h瑚LedⅡen。 ¨通讯作者：彭健，E一叫Ⅱ：per叼i蛐@mⅢL ·44l· 猪营养与镝科研究进展 1材料和方法 1．1菌株、质粒载体和抗体 菌毛阳性血清为华中农业大学分子营养实验室保存，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为sBA公司 产品。 1．2缸G基因的PcR扩增 根据Genebank中已报道的缸G序列(【29412)设计引物，如下： 5’ ccATcccAAlrAATAGTGGcGcGATG3’ 26Nt fasG—F(上游引物)： f如G—R(下游引物)：5’ 3’ 28Nt 在上游引物和下游引物中分别引人带有启始密码子(斜体加粗)的NcoI酶切位点和S8cI酶切 位点(见下画线)，扩增去除了信号肽的fasG基因，基因中自带了终止密码。 延伸10min，4℃存放。 1．3缸G基因的克隆 I和sac 对平板上的克隆进行质粒的小量提取，并对提取的质粒用Nco I进行双酶切鉴定。 1．4 faBG基因的表达质粒pE．128aG的构建 I和