YeastYNK1之功能相似基因之選殖與功能分析-陽明大學.docVIP

選殖及分析擬似人類G蛋白結合接受體基因的功能 Cloning and Characterization of A Human Putative G Protein-Coupled Receptor Gene 學 生 : 簡佳怡 (Chia-Yi Chien) 國立陽明大學 生命科學系 學士論文 National Yang-Ming University Department of Life Science Bachelor Thesis 中華民國八十九年五月 May, 2000 ABSTRACT 在整個人類基因體的研究過程中，如何鑑定新的人類基因及分析其功能是其中重要的一環。利用基因庫的資料，我們首先鑑定出一個未曾被發現的人類基因-BB29 DNA序列。透過選殖的步驟整個BB29基因的coding region 已經被選殖出來。BB29的基因大小共含有1125個核甘酸，能夠合成375個amino acids，amino acid sequence裡含有七個hydrophobic regions，seven transmembrane domain protein，G-protein coupled receptor。，human tissue blotting的結果，顯示BB29的表現並沒有組織專一性。kb專一的 transcript判斷BB29在人類細胞中應為單一的基因。Saccharomyces cerevisiae 當作一個研究模式，藉由研究酵母菌細胞內與BB29序列相似的兩個基因，來幫助我們瞭解BB29的功能。實驗初步的結果，將這兩個酵母菌基因破壞後，顯示這兩個基因為nonessential gene，，。。 INTRODUCTION 人類基因體計劃將於最近完成，，，。90%未知功能之人類基因所可能具有的生物活性，(1)。 phagemid cDNA library 中任意挑了1000 個cDNA clones，經初步定序之後，cDNA的部分序列，human expressed sequence tags (ESTs) database做比對，clones，(sequencher) 加以分析，open reading frames (ORFs) 的DNA序列片段，NCBI的non-redundant GeneBank 比對，clones，novel的部分，microarray的方法，normal cell 與cancer cell 中的表現程度有無差異，positive clones再進行完整的序列分析。clone，BB29 (Fig.1) 。BB29 在microarray的結果，normal cell與cancer cell 的表現量並無顯著的差異，BB29序列搜尋資料庫，BB29在mouse， Caenorhabditis elegans, Schizosaccharomyces pombeSaccharomyces cerevisiae 等四種生物之基因組中存在具有高度相似性的基因 (Fig.2) ，BB29和這些序列相似的基因，amino acid sequences， transmembrane domains (Fig.3)，G protein –coupled receptors(23)。BB29和這些在其他生物發現的相似基因都是novel genes，，，BB29在人類細胞中可能扮演一個重要的功能，因此值得我們進一步的加以研究。 為了能夠研究BB29的功能，我們將研究步驟設計成兩個方向同時進行，第一個部分是直接對human BB29 clone的研究 。S. cerevisiae 作為一個研究的模式。S. cerevisiae為簡單的單細胞真核生物，(9)，，，DNA的技術來研究酵母菌的基因特性，(20)，S. cerevisiae中擁有兩個ORFs : YOL002C與YDR492W，amino acid sequences與BB29有極高的相似性(4, 22)，，ORFs，ORFs被knock out 後，，phenotype，BB29 clone 轉殖至突變的細胞，BB29 是否可以功能性互補這些突變細胞，BB29功能的線索(3, 13)。 RESULTS Cloning of the Human BB29 cDNA 為了能夠研究BB29的功能，首先即是轉殖出含有完整protein coding region 的BB29 cDNA。因為初步從人類肝癌細胞的phagemid cDNA library 中得到的BB29 cDNA，cDNA的3 端，sequence上判斷並不含完整的coding region。cD