SELDI蛋白质芯片筛选差异蛋白分子的二级鉴定ppt.pptVIP

主要内容： 一、SELDI蛋白质芯片技术 二、差异蛋白质电泳方法 三、差异蛋白质的二级质谱鉴定 四、SELDI蛋白质芯片技术发展现状 五、SELDI蛋白质芯片技术发展趋势探讨 一、SELDI蛋白质芯片技术 二、差异蛋白质电泳方法 三、差异蛋白质的二级质谱鉴定 三、差异蛋白质的二级质谱鉴定 * * SELDI蛋白质芯片筛选差异蛋白分子的二级鉴定 1、定义 SELDI蛋白质芯片技术，即表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry)，是蛋白质组学研究中的一项新兴技术，在识别特定蛋白质表达物、蛋自质差异分析、测定血清中小分子物质含量方面提供了新的思路与方法 。 2、应用 该技术已经逐渐应用与临床，目前已见其应用于传染病、肿瘤等疾病诊断筛选的临床报道。SELDI蛋白质芯片技术与传统方法比较，SELDI技术对于5kDa以下的低分子量差异蛋白和低丰度的差异蛋白质的检出效果较佳，而且该技术具有高通量、上样量低和灵敏度高等优势。但经SELDI技术检出的差异蛋自质仅具有分子量特征，需进一步进行分离和准确鉴定。 1、Tricine-SDS分离蛋白 Tricine-SDS是用于分子量在1-10kD的肽类的方法。根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。 二、差异蛋白质电泳方法 2、双向凝胶电泳分离蛋白 根据蛋白质等电点和分子量差异连续进行成垂直方向的两次电泳。第一向为等电聚焦电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质分离。第二向为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），是按蛋白质分子量的大小进行分离的，再用考马斯亮蓝或P银进行检验，最后进行结果对比，解析 。 1 4 近年来，生命科学技术的创新和突破，尤其是质谱技术的革新，对蛋白质组学研究起到了关键的推动作用。质谱的数据结果是蛋白质组与序列数据库联系的桥梁。 质谱（mass?spectrometry，MS）的基本原理是在样品离子化后，根据不同离子质荷比的不同进行分离并确定分子量。质谱鉴定蛋白的方法具有灵敏度高，准确度高，易于实现自动化等优点。 80年代末，随着两种适合蛋白质研究的软电离方式的出现即电喷雾离子化（ESI）和基质辅助的激光解析离子化 （MALDI），使得质谱应用于生物大分子的鉴定成为可能。如今，质谱已成为蛋白研究中最重要的鉴定技术，是后基因组时代的关键核心技术。这种技术的应用范围已经从细胞，组织以及整个有机体中蛋白质的表达到蛋白质翻译后修饰等多个方面。包括蛋白消化、上样打点操作、上机检测及质谱数据库检索。 四、 SELDI蛋白质芯片技术发展现状 SELDI蛋白质芯片技术，是用于蛋白质组学研究的一项新技术，它是在MALDI 基础上改进后实行表面增强的飞行质谱。SELDI蛋白质芯片技术的出现为蛋白质差异分析提供了新的有力工具，目前已应用于如多种传染病及恶性肿瘤标志物检测中 。 Schagger等用Tris-Tricine体系代替Tris-glycine体系后可很好地分离分子量在1～100 kDa的蛋白质。该方法降低了分离胶的pH值(pH 8.45)，使蛋自质的移动速度变慢，提高了电泳分辨率；其次，解除短肽-SDS复合物与SDS颗粒的共迁移效应，改善小分子量短肽的电泳效果。 仉红刚等研究考察该方法的灵敏度与分辨率，结果发现大致在35-70kDa范围的蛋白(例如53kDa的微管蛋白-ɑ3)在Tricine-SDS中肉眼即能观察到清晰的分离条带-且重复性较理想。 五、SELDI蛋白质芯片技术发展趋势探讨 近年来随着质谱技术的不断进步，质谱分辨率越来越高，蛋白鉴定的电喷雾傅立叶变换离子回旋共振高分辨质谱也采用的是一种具有超高质量分辨能力的新型质谱仪，它将电喷雾离子化(ESI)技术结合于傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICR-MS)。在离子源的电离技术上和质量分析器上有着各自的优缺点。 在离子源的电离技术上 1 2 ESI技术与传统的电子轰击(EI)电离、化学电离(CI)、场解析(FD)离子化技术及快原子轰击(FAB)离子化技术相比，具有更适于离子性极性化合物、质荷比小于4000、化学噪音低、容易获得碎片离子信息、所鉴定蛋白质分子量可达1，000，000Da等优点，但其离子源结构复杂，易受Na+、K+等