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H Cloning vectors 载体的功能和应具备的特点 载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件 载体应具备的条件 1.具有对受体细胞的可转移性2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记 Cloning vectors H1 design of plasmid vectors H2 bacteriophage vectors H3 cosmids and YACs and BACs H4 eukaryotic vectors Design of plasmid vectors Characteristics of plasmid vectors Alteration of plasmid vectors Type of plasmid vectors Development of plasmid vector research Familiar plasmid vector Characteristics of plasmid vectors Independent from nuclear genome Autonomously replicating nucleic acids sequence Genetic stability Eukaryotic bacterial and epiphyte Most of plasmids consist of DNA. Most of plasmids are cccDNA (covalent, closed, circle) Mw range ：1 - 300 kb 质粒的不相容性 质粒的可转移性 携带特殊的遗传标记 质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： ? 严紧型复制控制的质粒 stringent plasmid 1 - 3 拷贝 ? 松弛型复制控制的质粒 stringent plasmid 10 - 60 拷贝 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群 以大肠杆菌的质粒为例： ? ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，不相容 ? pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，不相容 ? p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，不相容 质粒不相容性的分子机制 质粒不相容性的分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。 质粒的可转移性 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用，如Col、R的其它成员 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定 携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： ? 物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 ? 物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义 质粒的构建 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的： ? pSC101：8.8 kb，拷贝数5，四环素抗性标记基因 Tcr ? ColE1：6.5 kb，拷贝数20 – 30，大肠杆菌内毒素标记基因 E1 ? RSF2124：ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标记基因 Apr 质粒的分类 人工构建的质粒根据其功能和用途可