western blotting的试剂选择.pptx

Western Blotting;;细胞组织蛋白提取;;;二、WB过程试剂的选择;1.电泳 ? 1.1 制备凝胶 SDS胶浓度的选择;1.2 选择合适的对照? ??阳性对照??阴性对照??二抗对照??内参对照??空白对照 1.3 蛋白质分子量Marker 预染和非预染蛋白Marker 1.4 上样与电泳 ;2.转膜 2.1 杂交膜的选择 常用的转移膜类型有：PVDF?膜、硝酸纤维素膜（NC?膜）和尼龙膜。;2.2 转膜条件 具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定， 目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。 2.3 转膜效率检测 在转膜后使用丽春红（可逆染色）对杂交膜染色，同时使用考马斯亮蓝对转膜后的凝胶进行染色，检测凝 胶上的蛋白是否已经完全充分的转移到杂交膜上。（膜有很清晰的蛋白条带，而凝胶上无蛋白存在）。 使用预染蛋白Marker，检测Marker 的转移情况，当和目的蛋白大小相当的Marker 完全转移后即可停止， 但是有时需要相对延长一些时间，因为Marker 相对目的蛋白会比较容易转移。 ;2.4 大分子量或者小分子量蛋白的转膜注意事项 转膜缓冲液中SDS和甲醇的比例、蛋白分子量大小和凝胶的浓度都能影响到转膜的效率。对于一些大分子量或者小分子量的蛋白，可通过以下方法来增加转膜效率。 对于大分子量蛋白(100?kD)??? 大分子量蛋白转移很慢，就像他们在凝胶中分离的比较慢一样。确保大分子量蛋白的凝胶浓度低于8%。? 大分子量蛋白容易沉淀在凝胶中，难于转移，可在转膜缓冲液中加入0.1%的SDS来缓解该现象。另外甲醇可能会将SDS从蛋白中去除，所以将转膜缓冲液中的甲醇浓度降到10%或以下，可以使转膜更加容易进行。??? 只有在使用硝酸纤维素膜（NC膜）时，甲醇才是必须的。如果使用PVDF膜，可将甲醇从转膜缓冲液中去除（只在前期膜处理的时候使用甲醇）。?? ?选择在4℃转膜过夜，来替代常规的半干转膜。???? 对于小分子量蛋白(100?kD)?? ?SDS不利于蛋白质和膜的结合，小分子量蛋白??其明显。如果目的蛋白很小的话，可将SDS从转膜缓冲液中去除。?保持甲醇的浓度在20%。 目的蛋白大于500kDa 请参考以下文献来确定有效的转膜：? Bolt?and?Mahoney,?Highefficiency?blotting?of?proteins?of?diverse?sizes?following?sodium?dodecyl?sulfatepolyacrylamide,?gel?electrophoresis.Analytical?Biochemistry?247,?185–192?(1997).;2.5 关于转膜的其它注意事项： 避免直接使用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。 夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。?? 保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大或过小都会影响转膜效率? 鸡来源的抗体与PVDF?和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜.;;;内参的选择 选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白的种属来源、分子量的大小及目的蛋白表达部位。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。;;;如何快速摸出抗体最适条件;三、WB常见问题及分析;Thanks for your attention