DNARAN 琼脂糖凝胶电泳-培训课件.ppt

为了检测提取核酸的浓度和内参，需要继续做琼脂糖凝胶电泳实验 实验原理 （1）DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。 （2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶缓冲液 （1）制备凝胶和胶板： 100ml(1×TBE)+1g琼脂糖（ 三角瓶 ）， 煮胶，溶解，冷却至60℃(不烫手)，加EB替代物，倒板(4-6mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子 。 （2 ）加样： 5μl质粒DNA+1μl loading buffer ，混匀 5μlPCR产物+1μl loading buffer，混匀 （3 ）电泳：电压80-120V，注意电极 方向 15min （4 ）观察：紫外透射分析仪下观察。 电泳常见问题分析 DNA降解：避免核酸酶污染。 电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多次用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。 DNA变性：电泳前勿加热，可以在电泳仪上面放冰袋，避免温度高变性 条带浅，Marker弥散了---那要么就是胶的问题，要不就是buffer的问题。化胶的时候一定要化匀，buffer尽量用新鲜的实验室跑一般都是120V,最多跑到150V DNA电泳常见问题分析 问题 原因 解决办法 DNA带缺失 1)?小DNA带走出凝胶 缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度 2)?分子大小相近的DNA带不易分辨 增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度 3) DNA?变性 电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA 4) DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适 在脉冲凝胶电泳上分析 * * ⒋ 纯化RNA 核酸不溶于乙醇等有机溶剂，加2倍体积95%冰乙醇沉淀RNA，使其与其他杂质分开，再加1mL0.10mol/LNaOH溶解RNA，得到纯化的RNA提取液 沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点： ①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。 。 原理是： * ⒋ 纯化RNA 核酸不溶于乙醇等有机溶剂，加2倍体积95%冰乙醇沉淀RNA，使其与其他杂质分开，再加1mL0.10mol/LNaOH溶解RNA，得到纯化的RNA提取液 醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我们没有发现这二者对质量有大的影响，虽然许多人“发现”乙醇沉淀的核酸纯度更高。异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀的核酸比较蓬松，容易从壁上移动，颜色比较白。这是现象，提示结论：异丙醇沉淀的核酸不容易丢掉，但比较难洗涤。因此，少量核酸用异丙醇沉淀 ，大量核酸用乙醇沉淀 。 沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点： ①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。 。 原理是： * * * * * * * * DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 * * * * * 核酸的提取及琼脂糖凝胶电泳 目录 核酸 组成 理化性质 核酸分离、纯化的原则 核酸提取的基本步骤 材料准备 细胞裂解 分离、纯化 沉淀溶解 DNA提取的常用方法 RNA提取的常用方法 核酸的保存 琼脂糖凝胶电泳  核酸 DNA RNA Genomic DNA ( 原核、真核、病毒 ) 细胞器DNA ( 叶绿体、线粒体等) 质粒DNA ( 细菌、放线菌等 ) mRNA ( 1%-5% ) rRNA (80%-85%) tRNA(小分子RNA) (15%-20%) 核 酸(nucleic acid) 核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。 核酸的理化性质 理化性质 DNA化学性质稳定，物理上易碎，粘度大 RNA化学性质比DNA活泼，易受RNA酶的污染 溶解性 均溶于水 不溶于一般有机溶剂,在70%乙醇中形成沉淀