高职、专科专用医学生物化学课件--基因工程与PCR反应.pdfVIP

生物化学 Biochemistry 第九章 核酸的生物合成 基因工程与聚合酶链反应 Genetic Recombination and Genetic Engineering 第一节 基因工程 Genetic engineering 重组DNA技术发展史 1865年 G.J.Mendel 的豌豆杂交试验。 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传 工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的 药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。 一、基因工程相关概念 （一）DNA克隆 克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。 分子克隆-专指DNA克隆  技术水平： 分子克隆 （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物） DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的 DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或 转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细 胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也 称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 复制子 具有自我复制能力的DNA。 转化子 通过转化过程接纳了外源DNA的细胞。 嵌合DNA 将外源DNA插入载体分子所形成的复制子。 生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等。 基因工程(genetic engineering) —— 实现 基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重组 DNA技术。 目的 ①分离获得某一目的基因或DNA ②获得目的基因的表达产物（蛋白质） 二、基因工程技术工具 （一）工具酶 • 限制性核酸内切酶 • DNA聚合酶 Ⅰ • 逆转录酶 • T4DNA连接酶 • 碱性磷酸酶 • 末端转移酶 • Taq DNA聚合酶 重组DNA技术中常用的工具酶 工具酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作标记DNA探针 ③DNA序列分析 ④填补双链DNA3´末端 反转录酶 ①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 耐热DNA聚合酶 聚合酶链反应(PCR) 限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease) 识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其 周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。 Bam H Ⅰ