KDR酪氨酸激酶的克隆表达及纯化.pdfVIP

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2008, September 25; 24(9): 1545-1549 journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@im.ac.cn © 2008 Institute of Microbiology, CAS CSM, All rights reserved 研究报告 KDR 酪氨酸激酶的克隆表达及纯化 刘春平, 张洋, 李元 中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所, 卫生部抗生素生物工程重点实验室, 北京 100050 摘 要: VEGF 作为一种血管内皮细胞有丝分裂原, 通过与内皮细胞表面特定受体结合, 从而导致新生血管的形成, 其 中VEGFR-2(KDR/Flk-1)在肿瘤血管形成中起重要作用, 因此其抑制剂有可能发展成为治疗肿瘤的新药。采用大肠杆菌 成功表达了具有酪氨酸激酶活性的KDR 酪氨酸激酶催化域(KDR-CD) 。采用RT-PCR 从人脐静脉内皮细胞中提取总RNA, 获得KDR-CD 的编码基因, 将其克隆至pET-30a 载体, 在E. coli BL21(DE3) 中进行了成功表达, 采用Ni-NTA 亲和层析 对其进行了纯化, Western blotting 结果显示表达的KDR-CD 蛋白自身磷酸化, 重组KDR-CD 蛋白具有利用ATP 催化底 物发生磷酸化反应的激酶活性。 关键词: 血管生成, KDR 酪氨酸激酶, 大肠杆菌, 酪氨酸激酶活性 Cloning, Expression and Purification of KDR Tyrosine Kinase Chunping Liu, Yang Zhang, and Yuan Li Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics , Ministry of Health , Institute of Medicinal Biotechnology ; Chinese Academy of Medical Science and Perking Union Medical College, Beijing 100050, China Abstract: The catalytic domain of KDR kinase (KDR-CD) was amplified from RNA of HUVCEs cells with RT-PCR and expressed in E. coli BL21(DE3) by plasmid pET30a as vector. The recombinant protein was purified with affinity chromatography (Ni-NTA). Western blotting showed that the recombinant KDR-CD was phosphorylated in E. coli BL21(DE3). The recombinant KDR-CD was identified to have kinase activity catalyzing the substrate phosphorylated with ATP in the enzymatic reaction. Keywords: angiogenesis, KDR tyrosine kinase, E. coli, kinase activity. 血管生成(Angiogenesis)是毛细血管从已构建的 通过和其特异性受体结合发挥作用的,