第一节克隆载体分析.ppt

λ噬菌体载体的选择: 并没有一种可以适于克隆所有DNA片段的入噬菌体载体。具体选择时，应该考虑以下几点： ① 如果要从染色体DNA来构建基因组文库，那么可以选择置换型的λ噬菌体载体，因其可容纳DNA较大片段。 ② 如果要从染色体DNA中分离某一基因，而又不需构建完整基因组文库，那么选择的自由度就较大。 ③ 如果需要构建cDNA文库，那么常选λgt10或λgt11插入型载体；如果考虑选用抗体探针，那么常选λgt11这一有效表达载体。 （二） M13噬菌体 为了测序的需要，可应用丝状噬菌体产生单链DNA M13为丝状噬菌体家族成员，含有长度约为6400碱基的单 链DNA基因组。 M13是一种丝状病毒颗粒，它只能感染雄性细胞菌，并 不裂解宿主，相反，它甚至要从继续生长和分裂的感染 细胞中释放出来。 感染时，单链噬菌体基因组转变成称为复制型（RF)的双链环 状结构，它以凯恩斯复制(θ型复制 ) 。然后，RF分子以滚环方 式产生单链正链子代DNA分子，RF分子也作为M13噬菌体11个 基因进行转录的模板。 三个病毒基因产物（pⅡ,p Ⅴ pⅩ）用于病毒DNA的复制，五个 病毒基因编码跨膜蛋白（p Ⅲ ,pⅥ,pⅦ,pⅧ,pⅨ)构成外壳。 子代病毒颗粒是通过一个协同过程组装而成的。衣壳蛋白突入 细菌细胞膜，并围绕正链子代DNA装配，这一蛋白－DNA复合物 以丝状病毒颗粒形式分泌出细胞。 所有M13噬菌体基因组的顺式作用元件均集中在一个508bp 的基因间区，这一区域已被克隆到质粒上。当转化了这种 质粒的细菌被野生型或辅助M13噬菌体感染，单链形式的质粒 DNA就被包装入子代噬菌体。 由于其基因组不稳定，重组丝状噬菌体一般不用于外源DNA 片段的克隆和长期扩增，而用于制备已克隆于其他质粒上的 DNA片段的单链拷贝。 病毒颗粒　　　　　　 　　　　 　　　　实现病毒的增殖 利用此性质，可以构建各类病毒载体。 感染 利用其 体系 宿主细胞 DNA(RNA)复制和蛋白的合成 病毒 细菌病毒 植物病毒 动物病毒 称噬菌体，有双链的，单链的 如花椰菜花叶病毒， 烟草花叶病毒ＴＭＶ等 如SV40, 劳斯肉瘤病毒（反转录病毒） 腺病毒　哺乳动物和禽类中都有分布 痘苗病毒　在哺乳动物细胞胞浆中增殖 杆状病毒（感染昆虫等无脊椎动物） 即细菌病毒的总称 英文：Bacteriophage 简称phage. 该词来源于希腊文phagos,意为吞噬。 在结构上没有细胞结构，比原核和真核简单 但比质粒复杂，因为它还编码蛋白质外壳。 可以克隆和扩增特定的DNA片段。是一种良好的基因克隆 载体。 噬菌体概念 噬菌体的一般生物学功能 1 保护自已的核酸分子免遭环境化学物质的破坏 2 将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞 3 将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，大量 　　产生子代噬菌体。 4 使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒 噬菌体的结构与核酸类型 三种结构： 无尾部的二十面体型 具尾部的二十面体型（多数） 线状体型。 核酸类型： 双链环性DNA 单链环形DNA 单链线性DNA 单链RNA 不同种噬菌体核酸分子量相差较大。 个别有碱基替代现象。 如T4噬菌体中没有C，由5-羟甲基胞嘧啶取代。 SP01噬菌体中没有T,为5-羟甲基尿嘧啶取代 噬菌体的感染性 噬菌体的感染效率高到令人生畏的程度。 在琼脂糖平板上形成噬菌斑。 噬菌体的生命周期 噬菌体基因组整合到细菌染色体上称为溶源 吸附、注入，整合、复制 只能进行溶菌周期的噬菌体称为烈性噬菌体 形成清晰的噬菌斑 噬菌体的 生命周期 溶菌周期 溶源周期 吸附、注入，转变、合成 组装 释放 温和噬菌体，既能进入溶菌生命周期，又能进入溶源 生命周期。形成混浊的噬菌斑. 只有双链DNA的噬菌体才有溶源周期。 溶源性细菌：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫 溶源性细菌。 如果有某些噬菌体基因缺失了，不能完成其溶菌周期， 含有这种噬菌体的细菌叫做缺陷性的溶源性细菌。 溶源化lysogenization：用温和的噬菌体感染细菌培养物 使之形成溶源性细菌的过程。 整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA 之中，便叫做已整合的噬菌体DNA.这种噬菌体DNA组入细 菌染色体DNA的过程，称噬菌体DNA的整合或插入。以游 离DNA分子形式存在的噬菌体DNA，叫做非整合的噬菌体 DNA. 一些常见概念 原噬菌体：在溶源性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNA，叫做原噬菌体。 如:λ，e14 一般当这些质粒或原噬菌体缺失或变异时也用“( )”或“/”等加以区别表示。 另一种类型的溶源周期是以噬菌体P1为原型 这种类型的基本特征是不存在噬菌体DNA分子的整合 作用体系，而是变成了一种进行独立复