第三讲高效液相色谱的原理与构造.pptx

第三讲 高效液相色谱(HPLC)的原理与构造;内容概要;一、 什么是HPLC？;高效液相色谱的流程;二、高效液相色谱固定相和流动相; （3）化学键合固定相;化学键合固定相的特点：; 2.液-固吸附分离固定相;3.离子交换色谱分离固定相; 4. 空间排阻分离固定相;2.2 液相色谱的流动相;2. 流动相类别;3. 流动相选择;4. 选择流动相时应注意的几个问题;2.3 HPLC分类;2.4 HPLC的基本类型：;梯度： —在运行过程中溶剂组成变化； —渐变或台阶式变化。 100% H20/ 0% MeOH 到0% H2O/100% MeOH;三、HPLC分离公式与术语;基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。; 漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。 ;峰底——基线上峰的起点至终点的距离。 峰高(peak height，h)——峰的最高点至峰底的距离。 峰宽(peak width，W)——峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。 半峰宽(peak width at half-height，Wh/2)——峰高一半处的峰宽。;洗脱体积(V)和峰宽(W):;分离度（R）：分离程度的度量;保留因子（k’）：保留能力的量度;分离因子（α）：峰分离程度的量度;理论塔板数（N）：分离效率的量度;分离度方程式（R）：;?;?;分离度方程：分离因子α项;分离度方程：柱效N项;色谱峰对称性的测量方法;四、HPLC的构造;2016/10/17;4.1 真空脱气机;如果所用泵在低压端进行溶剂混合（如 Agilent 1200 系列四元泵），则需要进行脱气，因此必须配备一台真空脱气机或其他脱气系统（如用氦气进行脱气）。 单元泵和高压混合泵则通常不需要进行脱气。但在下述情况下，对于等度洗脱或高压混合泵也建议使用真空脱气机： —如果在低 UV 波长段、用最高的灵敏度进行检测， —如果分析要求使用最佳的进样精度，或 —如果分析要求保留时间重现性很高（在流速低于 0.5 ml/min 时必须使用）。 —如果样品或检测对流动相中溶解的氧敏感（降解）。;溶剂瓶中的溶剂在 LC 泵的抽取下流过真空箱内的特殊管状塑料膜。当溶剂经过真空管时，溶剂中溶解的气体将渗过塑料膜进入真空箱。当溶剂离开真空脱气机的出口时，几乎已被完全脱气。;4.2 四元泵;四元泵包括一个溶剂槽、一个真空脱气机和一个四通道梯度泵。四通道的梯度泵包括一个高速配量阀和一个泵组件。它通过低压混合来产生梯度。;四元泵的液路图;4.3 自动进样器;流路中为高压力工作状态； 通常使用耐高压的六通阀进样装置； 其结构如图所示： ;4.4 手动进样器;充样位置： —在充样位置 ，泵直接和柱子联接( 孔2 和孔3 联接)，并且针口和样品环联接。至少2 到3 倍样品环体积的样品通过针口注入，以便达到好的精度。样品填入环内，过量的样品通过和孔6 联接的排放管排出。;进样位置： —在进样位置 ，泵和样品环联接( 孔1 和孔2 联接)。将全部样品从环冲洗到柱。针口和排泄管( 孔5) 联接。;4.5 柱温箱;五、检测器;(1) 紫外检测器;紫外检测器的特点： —灵敏度高； —线形范围高； —流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）； —对流动相的流速和温度变化不敏感； —波长可选，易于操作； —可用于梯度洗脱。 ;（2）光电二极管阵列检测器;2016/10/17;光电二极管阵列检测器;（3）示差折光检测器;示差折光检测器;（4）荧光检测器;优点： —选择性强，灵敏度高，比紫外检测器高2-3个数量级，可达pg级别甚至更低，也可用于梯度淋洗。高灵敏度、高选择性； —对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。 缺点： —样品适用范围有限，定量分析的范围较窄（104-105）。;;六、色谱柱;色谱柱的一般结构;色谱柱的装填;不同填料的选择性差异;色谱柱填料颗粒尺寸演变的启示;分离能力的衡量：柱长与颗粒度的比值