半夏蛋白对人肝癌细胞Bel7402的诱导凋亡作用论文.docVIP

　　半夏蛋白对人肝癌细胞Bel7402的诱导凋亡作用论文 【摘要】 目的观察并比较半夏蛋白对体外培养的人肝癌细胞Bel7402的生长抑制作用。方法应用流式细胞技术，检测半夏蛋白对人肝癌细胞Bel7402的诱导凋亡作用，并观察了其诱导凋亡作用的量效关系。结果60%硫酸铵沉淀蛋白没有明显诱导Bel7402细胞凋亡的作用，而30%硫酸铵沉淀蛋白有诱导Bel7402细胞凋亡的作用。30%沉淀进一步分离结果显示，只有0.1 mol/L NaCl洗脱峰有一定诱导Bel7402细胞凋亡的作用。结论半夏蛋白有一定的诱导Bel7402细胞凋亡作用，其主要成分可能存在于总有机酸部位。 【关键词】 半夏提取物； 人肝癌细胞Bel7402； 细胞凋亡 Abstract：ObjectiveTo study the inducing apoptosis effects of Pinellia ternate protein on human hepatoma cell line bel7402. MethodsFloetry e effects, and 0.1 mol/L NaCl depository protein form 30% (NH4)2SO4 deposition also shoe effects. Conclusion The Pinellia ternate protein has some effects of inducing apoptosis of Bel7402, and probably the total organic acid is the main inducing apoptosis parts. Key an hepatoma cell line Bel7402; Apoptosis 半夏临床上可单独或与其它药物配伍用于治疗食管癌、卵巢癌及肝癌等。近年来对抗癌中药的研究发现，其作用途径主要是通过杀伤癌细胞、抑制细胞生长、诱导细胞凋亡、调节机体免疫功能来实现的［1］。研究也发现，半夏乙醇提取液、半夏总有机酸、掌叶半夏蛋白分别对肝癌细胞（HepG2）、胃癌细胞及卵巢癌细胞具有抑制作用［2～4］。然而不同产地半夏及其类似品所含的蛋白抗癌作用有何差异.freelresco公司；RPMI 1640（GIBCO产品）；RNase酶、碘化丙啶（PI）均购自Sigma公司；胎牛血清、新生牛血清（三利生物制品厂）。醋酸乙酯、石油醚、95%乙醇等其它均为国产分析纯。 1.3 细胞系及培养人肝癌细胞系Bel7402由武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）提供，用50 ml的培养瓶，将人肝癌细胞系（Bel7402）接种于含100 u/ml青霉素、0.1 g/L链霉素和10%新生牛血清的RPMI 1640培养液中，细胞浓度为2×104 ml，置于5% CO2，37℃的培养箱中培养。 1.4 仪器SHELLRB CO2恒温细胞培养箱；Olympus倒置显微镜；SHZ82A恒温震荡器；无菌操作台（苏州净化设备厂）；流式细胞仪（BD公司FACSCalibur型）；高速冷冻离心机（上海安亭离心机厂）；902型定时恒温磁力搅拌器；LDZX40立式电热压力蒸气灭菌器等。 2 方法及结果 2.1 半夏蛋白的提取分离新鲜块茎半夏洗净去皮，加入4倍体积0.05 mol/L TrisHcl(pH8.0)缓冲液及少量石英砂，高速匀浆后离心（8000 r/min，30 min），收集上清液，即得粗蛋白。 粗蛋白冷却到0℃，逐步加入固体（NH4）2SO4，当饱和度达到30%时，4℃静置2 h离心（8000 r/min，30 min），收集沉淀，得第1个分级沉淀部分。上清液继续加（NH4）2SO4至60%饱和度，4℃静置2 h后离心（8000 r/min,30 min），收集沉淀，得第2个分级沉淀部分。上清液加（NH4）2SO4至90%饱和度，静置无沉淀。 将上述2个分级沉淀部分分别用蒸馏水溶解，装入透析袋（透过分子量8000），用蒸馏水在4℃透析脱盐，更换透析液在检测不出（NH4）2SO4为止，把透析袋放入吸水性强的聚乙二醇（PEG，分子量20000）中，浓缩至小体积离心后去除沉淀。 将层析柱竖直固定在仪器车上，将DEAE Sepharose FF胶装入层析柱中，用0.05 mol/L TrisHCl(pH8.0)缓冲液平衡树脂，将30%（NH4）2SO4沉淀部分溶解后以0.5 ml/min上柱，分别以0.05 mol/L TrisHCl，0.05 mol/L NaCl,.freelol/L NaCl, 0.15 mol/L NaCl, 0.20 mol/L NaCl溶液以1 ml/min速