60Coγ射线对糖多孢红霉菌M的诱变效应研究.pdfVIP

摘要 60Co γ射线对糖多孢红霉菌 M 的诱变效应研究 摘要 随着抗生素耐药菌日益增多，迫切需要新的抗菌药物，酮内酯类抗生素在抗 感染耐药菌方面最有希望。通过同源重组的方法敲除糖多孢红霉菌 A226 染色体 上 KR6 基因构建了糖多孢红霉菌 M ，合成了 3-脱氧-3-羰基-红霉内酯 B ，一种新 的酮内类脂类化合物。然而其产量较低，而且产物没有抑菌活性，需进一步提高 其产量及糖基化修饰产生出抑菌活性产物。 60Co γ射线辐射诱变既能获得较高的突变率和较宽的突变谱，同时还有利于 筛选新的突变型。本试验以糖多孢红霉菌 M 为出发菌株，以孢子为材料，试验 6 60 初始糖多孢红霉菌 M 的孢子悬液浓度为 10 个/mL ，使用 Co γ射线为诱变源， 20%甘油吐温、20%DMSO 、1%吐温 20 制备孢子悬液进行辐照处理以纯水为空 白对照，稀释涂平板法计数，并根据计数结果计算致死率，选择适宜的溶液制备 孢子悬液和适宜的诱变剂量；采用适宜的诱变条件处理，并利用链霉素 R3M 抗 性平板来筛选突变体，发酵培养，取发酵液做枯草杆菌抑菌试验，筛选突变体， 计算有效突变率；并研究 γ射线对糖多孢红霉菌 M 的诱变效应。初步研究 LiCl 60 诱变及 LiCl 与 Co γ射线复合诱变糖多孢红霉菌 M 的诱变效应。 链霉素最低抑制浓度结果表明：随着链霉素浓度的提高，链霉素对糖多孢红 霉菌 M 的抑制作用增强，当链霉素浓度达到 100μg/mL 时菌株生长完全被抑制， 为最小抑制浓度。本试验采用 90μg/mL 的链霉素抗性平板来筛选抗性突变体， 以增大突变株筛选几率。 60 诱变筛选结果表明：糖多孢红霉菌 M 对 Co γ射线敏感，剂量越高，存活 60 率越低；使用 20%甘油吐温制备孢子悬液时 Co γ射线辐照诱变的效果较好，当 辐照剂量为 400Gy 时，致死率为 90.3% ，选择为适宜诱变剂量。通过 400Gy 60Co γ 射线辐射结合 90μg/mL 链霉素抗性筛选获得两株具有抑菌活性产物 的突变株，正突变率为 1.67‰，均斜面转接 5 代，其发酵产物抑菌活性基 I 60Coγ射线对糖多孢红霉菌 M 的诱变效应研究 本稳定。 60 诱变效应观察结果表明： Co γ射线诱变可以引起糖多孢红霉菌 M 的生 理形态变化，筛选的 1203 株链霉素抗性突变株中有 5 株生理形态发生较 大变化，形态变异率达到 4.16‰ ，突变株的孢子颜色、产孢时间、可溶色素、 菌落致密性等与糖多孢红霉菌 M 相比具有较大变化。 60 LiCl 、LiCl 与 Co γ射线复合诱变结果显示：糖多孢红霉菌 M 对 LiCl 60 比较敏感，随着培养基中 LiCl 浓度增加，致死率增高；使用 LiCl 与 Co γ 射线复合诱变具有协同作用。 通过 60Co γ 射线诱变结合链霉素抗性筛选的方法筛选突变体，可以显 著提高菌落形态变异率及正突变率。而且通过 γ 射线诱变得到的突变菌株具 有良好的遗传稳定性，大大减轻了筛选的工作量，提高了菌种选育的工作效率。 试验结果为进一步诱变选育红霉素高产菌株奠定基础。 60 关键词：糖多孢红霉菌；红霉素； Co γ射线；诱变育种 II