超高效液相色谱―串联质谱法同时检测人血浆中6种芥子气染毒标识物.docVIP

超高效液相色谱―串联质谱法同时检测人血浆中6种芥子气染毒标识物 　　摘要 针对芥子气（HD）染毒血浆的溯源性分析需求，采用超高效液相色谱串联质谱技术（UHPLCMS/MS），建立了人血?{中6种HD生物标识物（TDG，TDGO，SMO，SBMSE，MSMTESE，SBSNAE）的高灵敏度和专属性检测方法。应用甲醇和乙腈混合有机溶剂沉淀HD染毒血浆中的蛋白，然后用HLB柱固相萃取（SPE）纯化，经超高效液相色谱梯度洗脱分离，在三重四极杆串联质谱正离子多反应监测（MRM）模式下进行定性与定量检测。结果表明，6种目标物的线性范围为0.05～500ng/mL（R2=0.9840～0.9955），检测限在0.01～1.0ng/mL之间，各分析物的精密度（n=5）≤5.5%，加标回收率在86.5%～110.8%之间。本方法通过SPE的引入和UHPLC程序的优化，有效地解决了基质背景对分析可靠性的影响问题，并成功应用于国际禁止化学武器组织（OPCW）第5次生物医学样品分析演练HD染毒血浆样品的鉴定 关键词超高效液相色谱串联质谱；芥子气；生物标识物；血浆 1引言 芥子气（HD）是一种糜烂性化学毒剂，化学名为2，2′二氯二乙硫醚，可通过吸入、皮肤和眼睛暴露等方式中毒，造成皮肤、眼睛、呼吸道等出现不同程度的损伤[1，2＼]。两次世界大战以及80年代爆发的两伊战争中都使用了大量HD，造成了大量军民伤亡[3～5＼]。侵华日军战败后在中国境内遗弃了大量包括芥子气在内的化学毒剂，长期以来对环境以及附近平民都造成了严重危害[6，7＼]。1997年OPCW发布并生效的《化学武器公约》（CWC）严格禁止了HD的生产、储存和使用，但至今其销毁工作还未完成；同时由于HD容易生产、性质稳定，一旦被不法分子利用，还会极大地威胁公共安全。因此，有必要发展并建立灵敏、可靠的分析方法对HD染毒样品进行准确鉴定，对违约使用的调查取证、染毒人员的诊断救治都具有重要意义[8＼] HD含有两个亲电中心，进入生物体后迅速分布于各组织中，发生代谢反应可能生成水解氧化产物、β裂解产物和大分子加合物等一系列化合物[9，10＼]。这些代谢物按照其来源及特点分为两类：小分子游离代谢物和大分子加合代谢物[11～13＼]。小分子游离代谢物包括硫二甘醇（TDG）、硫二甘醇亚砜（TDGO）及芥子气亚砜（SMO）等水解、氧化产物，以及与谷胱甘肽加合后经β裂解酶作用产生的1，1′磺酰基双＼[2（甲基亚磺酰基）乙烷＼]（SBMSE），1甲基亚磺酰基2＼[2（甲硫基）乙基磺酰基＼]乙烷（MSMTESE），1，1′磺酰基双＼[2S（N乙酰半胱氨酰基）乙烷＼]（SBSNAE）等β裂解产物（如图1所示）。在小分子代谢物中，虽然文献＼[5＼]报道了在生物体内检测出痕量的内源性TDG和TDGO，但在HD染毒的生物医学样品中，TDG与TDGO的浓度显著升高，而且这些化合物均具有HD的结构特征，因此，这些小分子代谢物均可作为HD生物标识物[11＼]。与大分子加合物相比，小分子标识物在芥子气暴露后很快出现在体液中，能够在体内存在数日至两周，并且具有检测快速的优点，是染毒早期快速诊断的理想标识物 对于HD小分子标识物的分析，大多采用GCMS/MS或LCMS/MS等技术分析其衍生产物或原体[14～17＼]，但由于不同标识物的性质差异，这些报道大都只针对单个或两个标识物进行分析。但HD染毒剂量、方式以及染毒时间的不同所产生的生物标识物也不尽相同[16＼]，因此，所建立的方法应能更广泛用于标识物和样品的分析。直到2013年，Li等[18＼]报道了将血浆蛋白沉淀后直接进行LCMS/MS的分析方法，可同时检测7种HD游离代谢物。方法制备简单、耗时短，取得了较好的结果。但该方法中血浆经蛋白经沉淀直接分析，基质依然复杂，背景中存在大量干扰峰，分析大量样品后会造成色谱柱压升高、响应降低、仪器稳定性变差等问题 针对以上情况，本研究引入SPE制备方法，并优化了UHPLC的梯度洗脱程序，建立了血浆中6种HD标识物（TDGO，SBMSE，SBSNAE，TDG，MSMTESE和SMO）的UHPLCMS/MS定量分析方法。实验结果表明，本方灵敏度高、选择性好、样品基质纯净，大批量样品分析响应稳定、重复性好。JP 2实验部分 2.1仪器、材料及试剂 1290超高效液相色谱系统（美国Agilent公司）；6460型三重四极杆串联质谱系统（美国Agilent公司）；Centrifuge5424型高速离心机（德国Eppendorf公司）；NEVAP111型氮气吹干仪（美国OrganomationAssociates公司） HD、TDG、TDGO、SMO、SBMSE、MSMTESE及SBSNAE（均由本单位合成，N